川崎病患兒血清CaN、NFATc1水平與冠狀動脈損傷及治療效果的相關(guān)性分析

羅云嬌，甘泉，馬薇，杜麗江，魯智英，王美芬

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種急性、發(fā)熱性、全身血管炎性疾病，好發(fā)于5歲以下兒童，男∶女為1.9∶1，治療不及時會導致冠狀動脈損傷(coronary artery lesions，CALs)，甚至猝死[1]。CALs是KD最嚴重的并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計約30%KD患兒在急性期可出現(xiàn)冠狀動脈擴張，未接受靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)治療的KD患兒中20%～25%發(fā)生動脈瘤，經(jīng)治療患兒動脈瘤發(fā)生率在3%～5%[2]。KD發(fā)病機制復雜，目前認為是遺傳、感染和免疫相互作用的結(jié)果[3]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)是一種由鈣激活的蛋白磷酸酶，激活后可啟動Ca2+信號通路，上調(diào)白介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-12等炎性細胞因子表達[4]?；罨疶細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)屬于轉(zhuǎn)錄因子—活化T細胞核因子家族的重要成員，主要調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖、分化和發(fā)育，NFATc1受Ca2+信號通路調(diào)控，CaN激活Ca2+信號通路后引起NFATc1表達上調(diào)，繼而調(diào)節(jié)免疫反應[5]?，F(xiàn)檢測KD患兒血清CaN、NFATc1水平，分析其與KD患兒CALs和治療療效的關(guān)系，以期為臨床診斷、治療反應性評估提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年6月—2021年6月昆明醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院/昆明市兒童醫(yī)院感染科收治KD患兒106例(KD組)，男63例，女43例，年齡3～6(4.25±0.49)歲；體質(zhì)量11～28(18.63±5.41)kg；發(fā)熱時間2～12(6.29±1.69)d。另選擇醫(yī)院兒科門診體檢健康兒童38例為健康對照組，男25例，女13例，年齡4～6(4.40±0.55)歲，體質(zhì)量12～30(19.03±6.01)kg。2組性別、年齡、體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(18062)，所有受試兒監(jiān)護人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合KD診斷標準[6]；②急性期KD；③接受IVIG聯(lián)合阿司匹林治療。(2)排除標準：①猩紅熱、病毒感染；②復發(fā)性KD；③合并其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 實驗室指標檢測：KD患兒入院當日清晨、健康對照組體檢當日采集靜脈血5 ml，分裝為2管。其中1管(3 ml)室溫下靜置30 min，離心留取血清。用Varioskan LUX 多功能酶標儀以酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清CaN、NFATc1、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。另1管(2 ml)肝素抗凝，加入CD3-PE/CD4-FITC、CD3-PE/CD8-FITC、CD3-PE/CD56-FITC/CD16-APC抗體(購自北京四正柏生物科技有限公司)，經(jīng)避光孵育、洗滌，加入磷酸鹽緩沖液500 μl重懸細胞。FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)檢測CD3+、CD4+、CD8+T細胞所占百分比，計算CD4+/CD8+比值。

1.3.2 心臟超聲檢查：采用飛利浦iE Elite 四維心血管彩色超聲儀(探頭頻率3～8 MHz)，同步連接心電圖，于胸骨旁大動脈短軸、劍突下四腔心切面測量左、右冠狀動脈內(nèi)徑。根據(jù)測量結(jié)果進行冠狀動脈分級，分為4級：1級冠狀動脈內(nèi)徑正常，2級冠狀動脈輕度擴張、內(nèi)徑<4 mm，3級冠狀動脈中度擴張、內(nèi)徑4～7 mm，4級冠狀動脈重度擴張、內(nèi)徑≥8 mm[7]。

1.4 臨床治療效果評價[6]治療后仍持續(xù)發(fā)熱≥36 h或熱退后再度發(fā)熱為無效，治療后體溫恢復正常且未再發(fā)熱為有效。根據(jù)療效將患兒分為無效亞組16例和有效亞組90例。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清CaN、NFATc1比較 KD組血清CaN、NFATc1水平高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 2組受試兒童血清CaN、NFATc1水平比較

2.2 不同療效患兒血清CaN、NFATc1水平比較 無效亞組血清CaN、NFATc1水平高于有效亞組(P<0.01)，見表2。

表2 不同療效患兒血清CaN、NFATc1水平比較

2.3 2組血清炎性因子和細胞免疫指標比較 KD組血清IL-6、TNF-α水平，CD8+T細胞占比高于健康對照組(P<0.01)，CD3+、CD4+T細胞占比、CD4+/CD8+比值低于健康對照組(P<0.01)，見表3。

表3 2組受試兒童炎性因子和細胞免疫指標比較

2.4 2組冠狀動脈內(nèi)徑比較 KD組冠狀動脈分級：1級19例，2級47例，3級28例，4級12例。KD組左、右冠狀動脈內(nèi)徑均大于健康對照組(P<0.01)，見表4。

表4 2組受試兒童冠狀動脈內(nèi)徑比較

2.5 KD患兒血清CaN、NFATc1水平與其他指標相關(guān)性分析 KD患兒血清CaN、NFATc1水平與IL-6、TNF-α水平，CD8+T細胞占比、左冠狀動脈內(nèi)徑、右冠狀動脈內(nèi)徑、冠狀動脈分級呈正相關(guān)(P<0.01)，與CD3+T細胞占比、CD4+T細胞占比、CD4+/ CD8+比值呈負相關(guān)(P<0.01)，見表5。

表5 KD患兒血清CaN、NFATc1水平與其他指標相關(guān)性分析 (r/rs，P)

2.6 血清CaN、NFATc1預測KD臨床療效價值 血清CaN、NFATc1及二者聯(lián)合預測KD臨床療效的曲線下面積為0.709、0.688、0.852，二者聯(lián)合高于單獨檢測(Z/P=3.417/0.001、2.588/0.010)，見表6、圖1。

表6 血清 CaN、NFATc1預測KD臨床療效價值

圖1 血清CaN、NFATc1預測KD臨床療效的ROC曲線

3 討 論

KD臨床癥狀以發(fā)熱、彌漫性黏膜炎性反應、四肢末端水腫、皮疹和非化膿性淋巴結(jié)病為主，免疫和炎性反應是KD發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，免疫系統(tǒng)的激活，大量巨噬細胞、淋巴細胞、單核/巨噬細胞浸潤，激活免疫球蛋白、炎性因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等細胞因子，驅(qū)使白細胞、粒細胞遷移浸潤于血管炎性反應部位，引起脈管炎性反應癥狀[8-9]。CALs是KD引起的最典型心血管并發(fā)癥，血管內(nèi)皮細胞功能障礙在KD冠狀動脈損傷中起著非常重要的作用，KD患兒免疫系統(tǒng)異常激活，刺激血管內(nèi)皮細胞表達和釋放多種黏附因子，將炎性細胞黏附在內(nèi)皮細胞表面，引起血管內(nèi)皮炎性損傷，血管內(nèi)皮損傷進一步促使炎性因子分泌，并深入內(nèi)皮組織中，導致血管彈性層破壞，血管張力、脂質(zhì)代謝和凝血異常，促使血管重塑，形成冠狀動脈瘤[10]。

CaN是一種異二聚體蛋白質(zhì)，廣泛表達于心肌細胞、神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞、淋巴細胞等不同細胞類型，主要位于細胞質(zhì)中，CaN在細胞中鈣濃度增加時激活，并根據(jù)細胞環(huán)境對多種轉(zhuǎn)錄因子和離子通道的底物進行去磷酸化，進而激活信號通路傳導，參與細胞增殖分化、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、T細胞活化、炎性反應等多種病理生理過程[11]。NFATc1是CaN研究最充分的底物之一，通過直接與CaN結(jié)合，在多個N端富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域去磷酸化后轉(zhuǎn)移到細胞核中，并啟動基因轉(zhuǎn)錄，參與心臟病、骨質(zhì)疏松癥、血管性疾病等多種疾病發(fā)病過程[12]。越來越多證據(jù)表明，CaN/NFAT信號通路在控制髓細胞功能，病原體感染或組織損傷下免疫反應中具有重要作用，CaN可激活NFATc1，促使其去磷酸化，從而改變基因表達并促使T細胞增殖和分化，誘導免疫反應[13]。動物研究顯示，抑制CaN/NFATc1信號通路可抑制腫瘤壞死因子誘導的視神經(jīng)變性和軸突損失，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14]。

本結(jié)果表明，血清CaN、NFATc1與KD免疫炎性反應及CALs有關(guān)，推測CaN、NFATc1可能通過誘導免疫炎性反應參與KD及CALs發(fā)病過程?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，游離胞質(zhì) Ca2+濃度增加是KD易感及結(jié)局不良的主要因素，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+信號通路激活可促使T 細胞中CaN激活，導致T細胞活化，單核細胞、巨噬細胞分泌IL-1β和TNF-α，增加尾加壓素-2 信號傳導，誘導脈管炎性反應，加速血管內(nèi)皮細胞凋亡[15]。Lv等[16]發(fā)現(xiàn)，KD患兒NFATc1 mRNA和蛋白表達顯著升高，并在靜脈注射免疫球蛋白治療后降低。Wang等[17]報道顯示，CaN/NFATc1信號通路關(guān)鍵基因突變與KD易感有關(guān)。分析CaN、NFATc1參與KD的機制為：在應激刺激下細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，T 細胞中CaN被激活，激活的CaN使細胞質(zhì)中活化的NFATc1去磷酸化，去磷酸化的NFATc1易位至細胞核以調(diào)節(jié)細胞因子轉(zhuǎn)錄，介導黏附分子和促炎細胞因子表達[18]，進而促使炎性細胞浸潤，加劇血管炎性損傷，導致CALs?，F(xiàn)有研究表明，CaN/NFATc1通路在維持血管內(nèi)皮細胞正常結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用，CaN/NFATc1信號通路的激活與KD血管內(nèi)皮細胞的功能障礙和炎性反應有關(guān)，是引起KD血管并發(fā)癥發(fā)生和病情進展的主要因素[19]。

本結(jié)果顯示，血清CaN、NFATc1與KD治療效果有關(guān)，說明CaN、NFATc1是評估KD療效的生物學標志物。ROC分析發(fā)現(xiàn)，血清CaN、NFATc1聯(lián)合預測KD治療效果的曲線下面積為0.852，說明治療前血清CaN、NFATc1水平均升高提示更差的治療效果，臨床應優(yōu)化治療方案，改善患兒臨床結(jié)局。

綜上，KD患兒血清CaN、NFATc1水平均升高，高水平CaN、NFATc1與KD免疫紊亂、炎性反應及CALs程度有關(guān)。聯(lián)合治療前血清CaN、NFATc1水平可預測KD臨床療效，是KD潛在的生物學標志物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

羅云嬌：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；甘泉：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;馬薇：資料搜集整理，論文修改;杜麗江：進行數(shù)據(jù)收集,統(tǒng)計學分析;魯智英：課題設(shè)計，分析整理；王美芬：研究選題，論文終審