血清NFL、pNFH水平與急性缺血性腦卒中患者病情及預后的關系

郭改艷，王柳毅，吳瑞，師強，劉文慧，郝濤

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)占所有腦卒中類型的69.6%～70.8%，發病3個月內致死/致殘率為34.5%～37.1%[1-2]。AIS臨床癥狀和病情差異明顯，輕癥患者24 h內可完全緩解，重癥患者則出現認知功能障礙、身體殘疾甚至死亡，早期階段評估AIS患者病情和預后對臨床治療指導、預后改善有重要意義。神經元損傷時可引起軸突膜破壞，導致神經絲釋放到間質液中，進入腦脊液和外周血液，神經絲被認為是高度特異性結構神經元細胞骨架蛋白，與神經退行性病變、神經炎性反應及AIS均密切相關[3]。神經絲輕鏈(neuro filament light chian，NFL)屬于神經絲的亞型之一，現有研究認為，血清NFL水平升高與急性腦血管事件發生有關[4]。磷酸化神經絲重鏈(phosphorylation neuro filament heavy chian，pNFH)是除NFL外軸突細胞骨架的又一重要組成部分，兩者均可敏感反映軸突損傷和神經系統損傷[5]。鑒于此，現檢測AIS患者血清NFL、pNFH水平，分析其與AIS病情和預后的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年5月—2020年12月延安大學附屬醫院神經內科收治AIS患者113例為AIS組，男67例，女46例，年齡51～75(63.02±3.59)歲；體質量指數21～29(25.11±3.19)kg/m2；有吸煙史71例，飲酒史80例；合并癥：高血壓53例，糖尿病60例，高脂血癥48例；梗死部位：皮質區35例，皮質下42例，腦干27例，其他9例；梗死病因：大動脈硬化33例，小血管閉塞54例，心源性栓塞21例，其他 5例。另選擇同期于醫院門診體檢正常者106例為健康對照組，男69例，女37例，年齡51～72(62.77±3.42)歲；體質量指數20～28(24.36±3.02)kg/m2。2組性別、年齡、體質量指數比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準(批號2018-B017)，受試者或其家屬知情同意且簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①結合病史、體征、神經系統檢查及顱腦影像檢查診斷為AIS，符合“中國急性缺血性腦卒中診治指南2018”診斷流程和標準[6]；②年齡18歲以上。(2)排除標準：①既往AIS病史、短暫性腦缺血發作、腦外傷、顱內腫瘤；②近6個月內顱內手術或介入治療史；③合并肌萎縮側索硬化、神經內分泌譜系瘤、脊髓小腦共濟失調、周圍神經病、運動神經元疾病、阿爾茨海默病、帕金森病；④合并其他部位惡性腫瘤、感染、免疫性疾病患者。

1.3 檢測指標與方法 AIS組患者入院當日、健康者體檢當日采集空腹肘靜脈血 6 ml置于2支干燥試管和1支抗凝試管，干燥試管血液凝固后上清液離心取血清-20℃保存待測。

1.3.1 血清NFL、pNFH檢測：上述血清采用Kayto RT-6000酶標儀(深圳雷杜公司)及北京孚博生物科技有限公司的pNFH試劑盒和北京索萊寶科技有限公司NFL試劑盒，以酶聯免疫吸附試驗檢測血清NFL、pNFH水平。

1.3.2 炎性因子、糖脂指標、WBC、PLT檢測：上述血清采用Kayto RT-6000酶標儀以酶聯免疫吸附試驗檢測血清C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒購自北京博奧生物技術公司。BS-280全自動生化分析儀(深圳邁瑞公司)檢測空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)水平。上述抗凝試管血液混勻后采用西門子ADVIA 2120全自動血細胞分析儀檢測白細胞(WBC)、血小板(PLT)計數。

1.3.3 神經缺損程度評估：AIS患者入院當日采用美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評估神經缺損程度，NIHSS評分從意識、視野、凝視、面癱、上下肢運動、共濟失調、感覺、語言、構音障礙進行評分，評分越高神經功能缺損越重[7]。NIHSS評分<6分(輕癥亞組)36例，6分≤NIHSS評分<14分(中癥亞組)47例，NIHSS評分≥14分(重癥亞組)30例。

1.3.4 預后評估：AIS患者出院后定期電話隨訪，90 d后門診復查采用改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)[8]評估神經預后：0分，完全無遺留癥狀；1分，有遺留癥狀，但無功能障礙，能正常生活；2分，遺留輕度殘疾，但仍可以生活自理；3分，中度殘疾，能獨立行走，但需協助完成部分日常生活；4分，中重度殘疾，不能獨立行走，需協助完成大部分日常生活；5分，重度殘疾，臥床，大小便失禁，完全依賴他人完成日常生活；6分死亡。0～2分(預后良好亞組)85例，≥3分(預后不良亞組)28例。

2 結 果

2.1 2組血清NFL、pNFH水平比較 AIS組血清NFL、pNFH水平均高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 AIS組和健康對照組血清NFL、pNFH水平比較

2.2 不同神經缺損程度AIS患者血清NFL、pNFH水平比較 血清NFL、pNFH水平比較，重癥亞組>中癥亞組>輕癥亞組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同神經缺損程度AIS患者血清NFL、pNFH水平比較

2.3 影響AIS患者預后因素Logistic回歸分析 預后不良亞組患者年齡、高血壓患者比例、糖尿病患者比例、入院時NIHSS評分及血清FPG、CRP、TNF-α、NFL、pNFH均高于預后良好亞組，差異有統計學意義(P<0.05)，2組性別、體質量指數(BMI)、吸煙史、飲酒史、高脂血癥、梗死部位、梗死病因、WBC、PLT、TG、TC比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。以AIS患者預后為因變量(賦值：預后良好=0，預后不良=1)，年齡、高血壓、糖尿病、入院時NIHSS評分、FPG、CRP、TNF-α、NFL、pNFH為自變量，建立Logistic回歸模型，結果顯示，高NIHSS評分，高血清NFL、pNFH水平是AIS預后不良的危險因素(P<0.05)，見表4。

表3 不同預后AIS患者的臨床資料比較

表4 AIS患者預后影響因素的Logistic回歸分析

2.4 血清NFL、pNFH預測AIS患者預后的價值分析 血清NFL、pNFH預測AIS患者預后的最佳截斷值為7.15 ng/L、186.21 ng/L，曲線下面積(AUC)為0.686、0.732，二者聯合的AUC為0.903，且高于單獨NFL、pNFH預測(Z=3.258、3.015，P均=0.000)，見表5和圖1。

表5 血清NFL、pNFH預測AIS患者預后的效能

圖1 血清NFL、pNFH預測AIS患者預后的ROC曲線

3 討 論

AIS是臨床常見的致死、致殘性腦血管疾病，其發病與年齡、遺傳、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、飲食、肥胖等多種因素有關[9]。AIS發病機制復雜，能量代謝障礙、神經細胞凋亡、半暗帶去極化、神經炎性反應、興奮性氨基酸毒性等可能共同參與了AIS發病過程[10]。現有研究發現，AIS介導腦組織缺血缺氧可引起軸突生長抑制和神經元損傷，繼而導致一系列感覺、運動、學習和記憶等神經功能障礙[11]。神經絲是細胞骨架中間絲蛋白家族的成員，在軸突中含量非常豐富，具有誘導軸突徑向擴張，維持軸突細胞骨架，調節神經信號傳導等作用，神經絲異常是軸突損傷的標志物[12]。現有研究顯示，神經絲與帕金森病、阿爾茨海默病和肌萎縮側索硬化癥等神經退行性疾病有關，神經絲異常降解可導致認知功能障礙[13-14]。因此，檢測血清神經絲水平有望為AIS病情評估和預后預測提供參考。

神經絲包含NFL、神經絲介質和神經絲重鏈，其中NFL是目前研究最廣泛的亞型，任何引起神經元和軸突損傷的疾病均可增加腦脊液和血清NFL水平，NFL水平可反映神經炎性反應和神經退行性疾病軸突損傷的嚴重程度[15]。現有報道顯示，肌萎縮側索硬化癥患者血清NFL水平明顯增高，鑒別診斷肌萎縮側索硬化癥的敏感度和特異度分別為94%、88%[16]。NFL與神經內分泌譜系瘤導致的共濟失調或腦病，獲得性周圍神經病也存在密切關系[17-18]。本研究發現，AIS患者血清NFL水平明顯增高，且NFL水平隨著NIHSS評分的增加而增高，高水平NFL是AIS神經預后不良的危險因素，說明NFL參與AIS發病和進展過程。分析可能的機制為：AIS發生后大腦缺血缺氧導致軸突損傷，NFL自軸突釋放至外周血，導致血清NFL水平升高，神經元和軸突中NFL異常聚集和運輸失敗導致軸突變性，軸突口徑減少，神經纖維萎縮，神經傳導受損和神經元功能障礙[12]，臨床表現為神經缺損程度的增加和神經預后不良。有報道也指出血清NFL水平升高與腦卒中患者嚴重程度和較差的臨床結果相關[3，19]。本研究ROC分析結果顯示，血清NFL預測AIS患者預后的AUC為0.686，提示血清NFL有望作為AIS患者預后評估的潛在指標。

pNFH 為神經絲重鏈從軸突中神經細胞轉運翻譯后通過將磷酸鹽和 N-乙酰氨基葡萄糖連接到單個絲氨酸和蘇氨酸殘基上被修飾而成，是腦組織中磷酸化程度最高的蛋白質之一，軸突中約80%神經絲亞基是高度磷酸化的，只有高分子量亞基可沿其羧基末端尾部結構域被廣泛磷酸化。pNFH具有促使神經元發育，神經纖維信號傳導，抵抗蛋白質降解，維持神經元損傷后軸突細胞骨架穩定等作用，pNFH水平可反映神經系統再生和退化、軸突損傷和再生間平衡關系[20-22]。pNFH已被證實在肌萎縮側索硬化癥、脊髓小腦共濟失調、運動神經元疾病患者血液和/或腦脊液中濃度升高，且與疾病嚴重程度和縱向疾病進展相關，對神經系統疾病診斷和預后預測均有較高價值[23-25]。本研究發現，AIS患者血清pNFH水平明顯增高，且pNFH水平隨著神經缺損程度的增加而增高。由于pNFH是中樞神經系統軸突的結構蛋白，在正常條件下無法在血液中檢測到，細胞損傷導致其釋放到血液，因此血清pNFH的檢測表明AIS患者出現神經組織損傷。Peng等[26]研究發現，血清pNFH在AIS患者中升高，且與患者認知功能呈負相關，與本研究結果相似。本研究進一步發現，高水平pNFH是AIS神經預后不良的危險因素。推測可能的原因為：正常情況下，神經絲重鏈羧基末端尾部結構域在進入軸突并沿軸突運輸時被磷酸化，pNFH可促使軸突中神經絲積累，軸突徑向擴張，建立突觸連接和神經膠質細胞的雙向信號傳導[12]。AIS損傷神經元和軸突可導致神經絲重鏈異常磷酸化，導致軸突中pNFH過度積累和功能紊亂，損害動作電位傳導，影響突觸連接和信號轉導，引起神經纖維萎縮，導致神經缺損和神經預后不良。Pujol-Calderón等[27]研究也報道，pNFH與AIS患者繼發性神經變性呈正相關，有望作為監測AIS后原發性和繼發性神經軸突損傷的生物標志物。本研究ROC分析結果顯示，血清pNFH預測AIS患者預后的AUC為0.732，說明血清pNFH在AIS預后評估中也有較高應用價值。聯合血清pNFH和NFL后預測效能明顯提高，提示血清pNFH和NFL水平均升高可能預示著更高的不良結局發生風險，臨床應高度警惕，早期干預，以降低患者病死率和殘疾率。

本研究回歸分析結果顯示，高NIHSS評分與AIS預后不良也存在密切關系，說明AIS神經受損程度越重，患者預后越差，臨床對于高NIHSS評分患者應警惕遺留殘疾和死亡的風險。

綜上，AIS患者血清pNFH和NFL水平均升高，高水平pNFH和NFL與AIS患者神經缺損程度加重及神經預后不良有關，血清pNFH和NFL可作為AIS預后評估的潛在指標。本研究局限之處在于未檢測腦脊液中pNFH和NFL水平，外周血清中pNFH和NFL水平是否與腦脊液pNFH和NFL水平存在一致性尚不明確，需進一步研究證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

郭改艷：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；王柳毅：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;吳瑞：進行統計學分析;師強：課題設計，論文撰寫；劉文慧：分析試驗數據，進行統計學分析;郝濤：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改