PI3K/Akt通路對丙泊酚麻醉誘發大鼠腦損傷的影響

向思曲，朱賢林，葉剛，王在平，楊敏

丙泊酚是一種常用的靜脈全身麻醉藥物，呈乳白色液體狀，作為一種臨床常用的麻醉劑，其有可能會引起患者認知功能下降，從而引起腦損傷，在注射過程中可以出現局部疼痛，是因藥物對血管產生刺激導致，在此時間段接受藥物刺激能夠對腦的發育產生影響[1-2]。丙泊酚有起效迅速、誘導時間短、蘇醒快的優點，廣泛應用于外科臨床麻醉[3]。但有臨床研究顯示[4]，大腦早期接受丙泊酚暴露之后能夠導致海馬區神經元及神經膠質細胞凋亡，從而造成腦損傷，注射過程中如果給藥劑量偏大，或者和其他藥物協同，會引起低血壓和短暫性呼吸暫停。有臨床研究顯示[5]，磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號傳導通路能夠調節細胞生長、增殖、代謝等各種過程。現對SD大鼠進行丙泊酚麻醉，觀察PI3K/Akt通路在丙泊酚麻醉誘發大鼠腦損傷中的作用機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)研究對象：SD大鼠[河南省獸藥飼料監察所；合格證號：SYXK(豫)2021-0012]30只，月齡5～11(8.19±2.35)個月，體質量186～203(193.52±6.87)g，飼養環境為相對濕度45%～55%，溫度(21.23±4.46)℃，光照12 h/d環境下喂養1周。(2)試藥試劑：丙泊酚( 河北一品制藥有限公司)；PBS緩沖液(浙江聯碩生物科技有限公司)。(3)儀器設備：玻璃麻醉箱(北京雙玉科技有限公司)，散射光濁度儀(杭州聯測自動化技術有限公司)。

1.2 實驗方法 2020年3月—2021年4月在恩施土家族苗族自治州中心醫院進行丙泊酚麻醉誘發大鼠腦損傷實驗。大鼠30只按隨機數字表法分為對照組、2%丙泊酚組、4%丙泊酚組，各10只。將2%丙泊酚組、4%丙泊酚組大鼠分別置于玻璃麻醉箱內，并將浸潤2%丙泊酚、4%丙泊酚棉球的小燒杯50 ml分別置于玻璃麻醉箱內，觀察1 d，以神經功能評分1～3分為造模成功[6]。以動物出現四肢緊張度降低、呼吸變慢，皮膚痛覺消失，角膜放射遲鈍，表示大鼠進入麻醉期。對照組大鼠僅予1%氯化鈉肌肉注射。各組大鼠均干預4 d。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 大鼠學習記憶能力測定：準備直徑150 cm、高50 cm的圓形水池(水溫25℃)，并在其內標注4個點位，水池中央放入直徑10 cm、高30 cm的平臺。3組大鼠各取5只置于4點位處，統計各組大鼠自入水點游至預置平臺時間，于120 s內未游至平臺的大鼠引至平臺之上，將潛伏期記為120 s，大鼠在平臺上停留30 s之后，再將其放置其他不同入水點重新進行測試。所有大鼠均連續測試4 d，在第5 d時將大鼠從入水點放至水中，記錄60 s以內大鼠穿越平臺的次數；對以上大鼠所需要時間進行統計、匯總。

1.3.2 血清炎性因子檢測：大鼠干預4 d后取尾部靜脈血3 ml，離心提取上清液，置于-40℃環境下保存待用。根據提取的血清樣品呈現出的不同散射光度檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1 β，IL-1β)水平，在光探測器90°的單色光源中對樣品加入凝血激活劑，隨著樣品凝塊的發生，其散射光強度會隨之增加，當血清樣本完全凝固之后，其光照探測儀會隨之發生改變，隨后將血清樣本放置檢測器上進行處理并描繪出凝固曲線，按照凝固曲線對TNF-α、IL-1β水平進行評價。

1.3.3 腦組織病理及PI3K、Akt蛋白檢測：大鼠斷頭取腦組織，置于15%甲醇固定后常規石蠟包埋，連續切片，厚3 μm，進行HE染色；PBS緩沖液沖洗標本后，行30 min裂解，測定蛋白濃度。選擇20 μg /孔蛋白質，添加蛋白緩沖液后行電泳10 min，后將電轉膜浸于10%牛奶中，常溫環境下封存90 min。結合一抗、稀釋，孵育1 d，取出以TBST液沖洗，結合二抗，保存60 min后清洗、顯色，使用Western-blot法檢測PI3K、Akt表達。

2 結 果

2.1 3組大鼠學習記憶能力比較 對照組、2%丙泊酚組、4%丙泊酚組大鼠干預后第1～4 d水中逃避潛伏期隨時間均依次減少(F/P=20.070/0.001，28.440/0.001，18.720/0.001)，且4%丙泊酚組>2%丙泊酚組>對照組(P均<0.01)；穿越平臺次數比較，4%丙泊酚組<2%丙泊酚組<對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 3組大鼠學習記憶能力比較

2.2 3組大鼠腦組織病理變化比較 對照組大鼠腦組織黑色顆粒均勻分布，清晰可見，分界明顯，神經細胞未見異常變化；2%丙泊酚組大鼠神經組織腔隙增大，排列疏松，細胞核內藍染減少；4%丙泊酚組大鼠腦組織黑色顆粒分布過密，神經組織明顯空隙,見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織病理變化比較(HE染色，×200)

2.3 3組大鼠血清炎性因子比較 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較，4%丙泊酚組>2%丙泊酚組>對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 3組大鼠血清炎性因子比較

2.4 3組大鼠腦組織PI3K、Akt表達比較 腦組織P-PI3K、P-Akt蛋白表達比較，4%丙泊酚組<2%丙泊酚組<對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3、圖2。

表3 3組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達比較

圖2 3組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白印跡圖比較

3 討 論

丙泊酚作為一種新型的靜脈麻醉藥，因其起效快、蘇醒迅速、不良反應少、持續靜脈滴注后無蓄積作用等特點，己廣泛應用于臨床各科的手術麻醉[7]。有研究表明，丙泊酚麻醉對急性重型顱腦損傷及腦缺血再灌注患者中具有安全、可靠的麻醉效果。丙泊酚還具有吸收迅速及持續輸注后不易儲積、蘇醒完全等特點[8-10]。但有學者認為，使用丙泊酚麻醉可能會導致長時期行為改變，學習、記憶等功能出現異常，造成中樞神經損傷，導致腦損傷的出現[11]。

TNF-α是腦創傷后較早釋放的重要促炎細胞因子，在腦組織中高度表達具有神經毒性，可加速神經細胞的死亡[12-13]。IL-1β可通過激活膠質細胞，使其釋放細胞因子、自由基等參與腦內炎性反應。IL-1β過量表達可能通過多種途徑在腦損傷中介導神經元的死亡、缺失，引起繼發性腦損害[14-15]。有臨床研究顯示[16]，丙泊酚麻醉能夠導致大鼠炎性因子異常，出現TNF-α、IL-1β表達上升，由此可見，使用丙泊酚能夠改變大鼠TNF-α、IL-1β表達，增加大鼠海馬區的細胞凋亡率，最后導致大鼠出現腦損傷。本結果顯示，丙泊酚麻醉大鼠穿越平臺次數降低，各時間點逃避潛伏期較長，并受丙泊酚濃度升高影響，高濃度丙泊酚麻醉大鼠各時間點逃避潛伏期更長，穿越平臺次數更低，由此得出，丙泊酚麻醉能夠對大鼠神經元造成損傷，激發炎性因子釋放導致患者認知功能及學習功能下降。

PI3K/Akt信號通路是一種促神經細胞生存的信號通路，mTOR也是該通路主要的下游效應因子之一[17]。PI3K是脂質激酶家族一員，通過磷酸化質膜磷脂酰肌醇上的3-羥基來激活，但PI3K可以直接被細胞表面受體激活[18]。Akt是PI3K信號轉導通路中的關鍵分子，在細胞存活和凋亡中起重要作用。PI3K/Akt對腦損傷研究較少，其作用有待進一步證實[19]。有研究表明，激活PI3K/Akt通路能抑制炎性反應和神經細胞凋亡，減輕大鼠腦損傷面積，改善大鼠腦組織病理形態及神經癥狀[20]。本研究發現，丙泊酚麻醉誘發腦損傷大鼠模型中PI3K、Akt表達均呈現出下降趨勢，通過抑制腦外傷后神經細胞凋亡，阻斷PI3K/Akt信號通路抑制腦損傷惡化。由此可見，使用丙泊酚麻醉能夠激活PI3K/Akt通路且通過PI3K/Akt通路誘導大鼠產生腦損傷。

綜上所述，使用丙泊酚麻醉能夠通過PI3K/Akt通路激活炎性反應，最終導致腦損傷的發生。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

向思曲：資料整理及統計分析，論文撰寫；朱賢林：提出研究思路及設計研究方案；楊敏：實施研究過程；葉剛、王在平：論文修改