青龍衣化學成分體內抗腫瘤作用及其急性毒性試驗研究

周媛媛，劉寧雨，馬丹娜，高蕙蕊，張曉娟，劉雨新，方振興

(1.黑龍江中醫藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.日本島根大學醫學部，日本 島根縣 6938501；3.黑龍江省科學院自然與生態研究所，黑龍江 哈爾濱 150040)

青龍衣為胡桃科植物胡桃楸(JuglansMandshuricaMaxim)的果實青皮，又名胡桃青皮，青龍衣一名始見于《山東中草藥手冊》[1-3]。《中藥大辭典》記載其味辛、苦，性澀、平，以清熱解毒、祛風療癬、止痛止痢等功效入藥[4-5]。據文獻報道，青龍衣的主要化學成分包括萘醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、三萜類、有機酸類及多糖類等，其中部分類型化合物穩定性差、具有揮發性或易氧化的特點[6-7]，如一些小分子萘醌苷元、鞣質類成分等。青龍衣的抗腫瘤活性強，且治療范圍廣，目前臨床上已用于治療胃癌、肺癌、食管癌等疾病[8-9]。李彩霞等[10]研究表明，核桃青皮粗提物可以引發KYSE150人食管癌細胞的細胞周期阻滯在G0/G1期，并且可以通過線粒體途徑誘導KYSE150細胞凋亡。高啟龍等[11]研究證明，青龍衣含藥血清通過誘導凋亡與抑制Wnt/β-catenin通路的活化對人胃癌細胞 SGC-7901細胞產生抑制作用。王爽等[12]發現青龍衣提取物能明顯抑制Lewis肺癌細胞的增殖，抑制率為85.4%(P<0.05)。為了進一步研究青龍衣中抗腫瘤藥效物質基礎，本實驗對青龍衣中分離出的6個單體化合物進行了細胞毒性、急性毒性相關研究，也為進一步開展抗腫瘤機制研究提供參考。

1 材料

1.1 藥材

本實驗所用青龍衣藥材于2018年采集自吉林長白山山脈，經黑龍江中醫藥大學中藥資源教研室王振月教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物胡桃楸(JuglansMandshuricaMaxim)的未成熟外果皮，目前樣品保存于黑龍江中醫藥大學藥學院中藥化學實驗室。

1.2 細胞株

人胃癌BGC-823細胞、腸癌HCT-15細胞由哈爾濱醫科大學腫瘤研究所提供。

1.3 動物

昆明小鼠180只，雌雄各半，體質量18～22 g，購于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(遼)2020-0001，自由飲水，定時通風，濕度保持40%～60%，平衡飼養1周后進入正式實驗。

1.4 實驗儀器與試劑

CO2培養箱(美國Thermo公司)；多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(日本Tokyo公司)；超凈工作臺(上海力申科學儀器有限公司)；超低溫冰箱(美國 Thermo公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國HyClone公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(美國Thermo公司)；二甲基亞砜(DMSO，天津市富宇精細化工有限公司)；96孔培養板(美國Corning公司)；噻唑藍(MTT，大連美侖生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 細胞毒實驗

取96孔培養板，四周培養孔設置為空白組，加入PBS 200 μL/孔，剩下的孔進行正常接種，取生長狀態良好的腫瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶消化使其脫壁，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液稀釋細胞，使其濃度范圍在(4×104)～(7×104)個/mL，按100 μL/孔加入孔板內，每一個篩選條件均設置3個復孔，并設置不加細胞的完全培養基孔為空白對照，向每孔分別加入濃度為8、6、4、2、1 mg/L的待測樣品溶液20 μL。于37 ℃ 5% CO2條件下常規培養4 h后，每孔加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，棄去培養液，每孔加入120 μL DMSO，然后進行顯微鏡觀察細胞形態，酶標儀570 nm處測定OD值。以配置各化合物的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制濃度效應曲線，計算IC50值。

2.2 急性毒性試驗

按寇氏法每組10只小鼠，以正常小鼠為空白對照，胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A藥物溶液以0.2 mL/10 g體質量腹腔注射，各組藥物濃度根據小鼠平均體質量(20 g)水平計算，腹腔注射后觀察動物行為、攝食、分泌物、排泄物以及中毒死亡情況，連續觀察2周。

3 結果

3.1 對BGC-823 細胞、HCT-15細胞形態的影響

在光學顯微鏡下空白組的BGC-823和 HCT-15細胞數量明顯增多，胞質豐富、胞核較大，相鄰細胞生長融合成片，貼壁牢固，折光性好。分別給予化合物胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A處理后的BGC-823細胞均出現不同程度的凋亡現象，細胞相對較小，胞漿減少，核固縮，部分細胞碎裂，具體情況如圖1所示。

注:A.對照組;B.胡桃醌組;C.3-乙氧基胡桃醌組;D.12β,20(R),24(R)-三羥基達瑪烷-25-烯-3-酮組;E.20(S)-原人參二醇組;F.2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸;G.Juglanin A組。圖1 顯微鏡下觀察空白組及各藥物組的BGC-823、HCT-15細胞形態(×200)

3.2 對各瘤株細胞IC50值測定

胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸以及Juglanin A對BGC-823細胞和HCT-15細胞均有細胞毒作用，且敏感度具有差異性。且針對BGC-823細胞和HCT-15細胞均以胡桃醌的IC50值最小分別為(9.6±2.35)μmo1/L和(27.8±2.66)μmo1/L，說明胡桃醌對人胃癌BGC-823和人腸癌HCT-15細胞的抗體外增殖作用均表現最強，抑制率情況見表1。

表1 6個單體化合物對BGC-823和HCT-15的IC50值比較

3.3 急性毒性試驗結果

最高劑量組給藥6 h后發現胡桃醌組小鼠出現不安，呼吸急促，隨后0.5 h內死亡。其他給藥組高劑量組僅見運動遲緩，精神萎靡，嗜睡不食等現象。通過觀察死亡情況，計算小鼠LD50值情況及置信區間見表2。

表2 6個單體活性成分LD50(n=10，mg/kg)

4 討論

實驗對青龍衣的6種化學成分胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A分別進行了細胞毒活性和急性毒性試驗。細胞毒實驗結果表明，6種化合物均有細胞毒作用，其中胡桃醌細胞毒作用最強，IC50值為(9.6±2.35)μmo1/L和(27.8±2.66)μmo1/L。而急性毒性試驗結果表明，6種化合物均有急性毒性作用，其中胡桃醌毒性作用最強，LD50值為33.57 mg/kg，95%置信區間為29.53～38.16 mg/kg。本研究進行了青龍衣的急性毒性試驗研究，從而為初步判斷青龍衣的毒性大小及可能存在的危害提供了實驗基礎，為后續的長期毒性試驗以及藥效學實驗提供了劑量參考，而且也可以通過實驗中小鼠的急性毒性反應癥狀，來推測青龍衣在小鼠體內的藥動學變化，為青龍衣的藥動學研究奠定實驗基礎。

研究結果表明，這些化合物均為青龍衣中抗腫瘤活性成分，其中胡桃醌表現出良好的體外抗腫瘤活性，但是胡桃醌同樣具有明顯的毒性作用，提示雖然胡桃醌在開發抗腫瘤新藥方面有較大研究價值，但需要進行適當結構修飾改造或尋找其他“高效低毒”化學成分進行替代，本實驗中三萜類成分如20(S)-原人參二醇既具有較好的細胞毒活性又兼具低毒性特點，具有良好的抗腫瘤研究前景。