金蕎麥膠囊體外抑菌實驗*

童曉東，毛一鑫

1 南通市中醫院（南京中醫藥大學南通附屬醫院） 江蘇南通 226001

2 南京中醫藥大學藥學院 江蘇南京 210023

金蕎麥為蓼科植物金蕎麥Fagopyrum dibotrys（D.Don） Ham的干燥根莖[1]。金蕎麥治療肺膿腫， 具有比較快的退熱速度， 而沒有抗生素常有的過敏反應和耐藥性，有較高的痊愈率，作為首選藥物用于治療亞急性﹑急性肺膿腫[2-3]，研究表明金蕎麥對枯草芽孢桿菌﹑金黃色葡萄球菌﹑大腸桿菌﹑肺炎球菌等具有抑制作用[4-6]。臨床常用于呼吸系統感染[7-8]。

金蕎麥膠囊為金蕎麥的乙醇提取物而制成，本實驗考察金蕎麥膠囊的體外抑菌效果，以平皿稀釋法初步研究金蕎麥膠囊最低抑菌濃度，以牛津杯法考察研究金蕎麥膠囊體外對大腸桿菌﹑乙型溶血性鏈球菌﹑銅綠假單胞菌﹑金黃色葡萄球菌抑菌活性，為臨床應用提供依據。

材料與方法

1 儀器與材料

1.1 儀器 YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器，SPX-250B-Z生化培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；BSC-1304IIA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HT-100B臺式恒溫搖床（上海赫田科學儀器有限公司）。

1.2 試藥 金蕎麥膠囊（批號：20201206，本課題自制）；金蕎麥合劑（批號：20201217，本院自制）；金蕎麥片（批號：20201124，精華制藥集團股份有限公司）；營養肉汁瓊脂（批號：20201206，上海廣銳生物科技）

1.3 菌種 銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC? 27853?，批號2021/03/16；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC? 25923?，批號2021/03/31；大腸桿菌Escherichia coli ATCC?25922?，批號2021/03/09（Thermo Scientific）；乙型溶血性鏈球菌Streptococcus hemolytic-β CMCC（B）32210，批號210222（南通凱恒生物科技）。

2 試驗方法

2.1 菌懸液的制備[9]取適量營養肉汁瓊脂，加適量純凈水溶解，滅菌，置無菌培養皿中，放置室溫備用。銅綠假單胞菌﹑乙型溶血性鏈球菌﹑金黃色葡萄球菌﹑大腸桿菌等標準菌株分別接種于營養肉汁瓊脂培養皿中，培養48 h于35 ℃，置 4 ℃生物冷藏箱中備用，分別取出培養好的各菌種，用無菌接種鏟刮下菌體，用無菌水稀釋溶化，分別用無菌的0.9%氯化鈉溶液按10倍逐級添加稀釋上述各菌種培養液，制成各不同梯度稀釋級的菌懸液。采用平板計數法測定含菌量， 105～106cfu/mL的菌懸液選為備用，置2～8 ℃生物冷藏箱保存。

2.2 金蕎麥膠囊 MIC和MBC試驗[10]將金蕎麥膠囊用無菌水制備成100g/L質量濃度的母液。取10支小試管，滅菌， 1～10依次編號，原液分別用無菌蒸餾水固定倍量均勻稀釋至9個濃度梯度，配制混合成各含金蕎麥膠囊質量濃度為100﹑50﹑25﹑12.5﹑6.25﹑3.13﹑1.56﹑0.78﹑0.39g/L 的 系 列 藥液，取18mL營養肉汁瓊脂培養基與2mL各濃度的藥液混均勻后平鋪于無菌培養皿，制備成含各濃度的藥液瓊脂平板。10號管作為陽性對照管不加藥液，9號管作為陰性對照管不加菌液。1至8號管﹑10號管分別加入0.1 mL菌懸液，將接種好菌液的瓊脂平板浸干后置于35 ℃生化培養箱中培養18 h。分別做重復試驗3 次，根據3次實驗的結果，沒有細菌生長的溶液的最大稀釋度為最小抑菌濃度（MIC）， 沒有菌落形成的溶液的最低濃度為最低殺菌濃度（MBC）。

2.3 牛津杯法測定金蕎麥膠囊抑菌效果 將100μL銅綠假單胞菌﹑金黃色葡萄球菌﹑乙型溶血性鏈球菌﹑大腸桿菌菌液分別加入4個營養肉汁瓊脂培養基上，涂布均勻，在平板中央放置已滅菌的牛津杯，分別牛津杯內加入200μL的 50mg/mL的金蕎麥膠囊藥液，為使藥液均勻擴散于瓊脂上，先置4℃冰箱中靜置8h，再置生化培養箱中37℃培養18h。測量抑菌圈直徑。每項菌種做3組，計算其平均值[11]。

結 果

1 金蕎麥膠囊MIC和MBC試驗結果

金蕎麥膠囊對金黃色葡萄球菌﹑銅綠假單胞菌﹑乙型溶血性鏈球菌的MIC為12.5 g/L，大腸桿菌的MIC為25g/L；金蕎麥膠囊對銅綠假單胞菌﹑金黃色葡萄球菌﹑乙型溶血性鏈球菌的MBC為50 g/L，大腸桿菌的MBC為100 g/L。見表1。

表1 金蕎麥膠囊的 MIC﹑MBC

2 金蕎麥膠囊的抑菌效果

根據美國臨床實驗室標準化委員會（ NCCLS /CLSI） CLSI M100抗微生物藥物敏感性試驗的執行標準第29版（2019）標準，抑菌圈試驗的敏感判定標準為：抑菌圈低度敏感5～10 mm，中度敏感10～20 mm，最敏感直徑為＞20mm，≤5 mm無抑制作用者為不敏感[11]。實驗結果表明，金蕎麥膠囊對金黃色葡萄球菌﹑銅綠假單胞菌﹑乙型溶血性鏈球菌為中度敏感，對大腸桿菌為低度敏感，其對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好。見圖1﹑表2。

圖1 金蕎麥膠囊對供試菌的抑菌作用

表2 金蕎麥膠囊對供試菌的抑菌圈的影響

討 論

金蕎麥膠囊是在我院獲得國家級成果（國家二級甲等科技進步獎）“新藥金蕎麥”醫院制劑金蕎麥合劑的基礎上研制而成?，F代化學研究認為金蕎麥主要含有黃酮類﹑甾體﹑萜類以及酚類等化學成分[13]，其中黃酮以及酚酸類化合物藥理研究對乙型溶血性鏈球菌﹑肺炎球菌具有抑制作用，并且可以為肺炎球菌菌株所致的小鼠提供保護，尤以表兒茶素為其主要活性成分，（-）表兒茶素類活性物質對枯草芽孢桿菌﹑金黃色葡萄球菌﹑大腸桿菌等均有抑制作用。這為金蕎麥治療肺膿腫，及現在用于感染提供依據，金蕎麥中生物類黃酮在體內及體外均有較強的抑菌活性，但提取方法的不同對金蕎麥的抗炎﹑抑菌作用有明顯影響，包鵬等認為金蕎麥浸膏的體內體外沒有抑菌活性， 在水提物和醇提物的抑菌活性體外研究中，乙醇提取物的抑菌活性較好， 不同濃度的乙醇提取物對動物主要體內致病菌群有不同程度的抑菌活性作用[14-17]。也有報道認為金蕎麥根莖的乙醇提取物的體外抑菌作用優于水提和黃酒悶提的作用，而且對“金葡”“肺球”有較明確的抑制作用[18-20]。

金蕎麥膠囊也具有清熱解毒，排膿生肌。臨床主要用于肺膿瘍﹑扁桃體周圍膿腫﹑麻疹肺炎。肺膿瘍主要致病菌主要為肺炎克雷伯桿菌﹑銅綠假單胞菌以及大腸埃希菌等；革蘭陽性菌主要為金黃色葡萄球菌和鏈球菌[17]。體外抑菌實驗也支持其臨床作用。金蕎麥膠囊對金黃色葡萄球菌﹑銅綠假單胞菌﹑乙型溶血性鏈球菌的MIC為12.5 g/L，大腸桿菌的MIC為25g/L；金蕎麥膠囊對銅綠假單胞菌﹑金黃色葡萄球菌﹑乙型溶血性鏈球菌的MBC為50 g/L，大腸桿菌的MBC為100 g/L，對臨床金蕎麥膠囊的使用量提供依據。金蕎麥膠囊對銅綠假單胞菌﹑金黃色葡萄球菌﹑乙型溶血性鏈球菌具有明顯的抑菌作用，對大腸桿菌抑菌作用較弱?？梢蕴娲鹗w麥合劑在臨床應用。

由于疫情原因，沒有做肺炎鏈球菌﹑肺炎克雷伯桿菌的體外抑菌實驗，但有王立波等對金蕎麥乙醇提取物乙酸乙酯的萃取部分肺炎球菌有明顯的抑制作用[21]，待以后進一步的研究。

牛津杯法測定金蕎麥膠囊抑菌效果中金蕎麥膠囊藥液濃度的選擇，因金蕎麥膠囊是在金蕎麥合劑基礎上研制，金蕎麥合劑的臨床用量為40mL/次，按工藝換算為0.25g/mL的金蕎麥原藥材濃度，結合金蕎麥膠囊的得膏率大約為20%，以金蕎麥膠囊臨床每次使用量為依據，確定牛津杯法測定金蕎麥膠囊抑菌效果中金蕎麥膠囊藥液濃度為50mg/mL。