仁青常覺對家兔急性呼吸窘迫綜合征的保護作用研究*

姚夢琪，付淑艷，周自強，更桑，色里瑪，白瑪羅布，孫芳云，

1 西藏民族大學醫學部 藏藥檢測技術教育部工程研究中心 陜西咸陽 712082

2 西藏藏醫藥大學 西藏拉薩 850000

3 西藏甘露藏藥股份有限公司 西藏拉薩 851414

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS ）是指由于肺組織內外嚴重疾病導致的頑固性低氧血癥，可引起彌漫性肺泡毛細血管損傷，肺毛細血管通透性增加而導致高通透性肺水腫。ARDS的臨床癥狀為發熱﹑咳嗽﹑咳痰等，其中嚴重的癥狀是呼吸困難，因為病情進展快，從而導致肺功能不全，患者會在短時間內出現呼吸衰竭等嚴重癥狀，病死率高達50%[1]。Matthay等[2]認為 ARDS 其實是彌漫性肺泡毛細血管損傷，肺毛細血管通透性增加所導致的高通透性肺水腫.目前西醫治療ARDS的主要方式是輔助性機械通氣﹑控制體液的交換以及抗感染等，但是其臨床死亡率仍然居高不下。藥物使用較多的是糖皮質類激素等藥物，雖有一定的療效，但副作用多，達不到預期的效果。

仁青常覺是珍貴的藏族驗方[3]，2015年收錄于《中華人民共和國藥典》，由珍珠﹑朱砂﹑檀香﹑降香﹑訶子﹑牛黃﹑麝香﹑西紅花等160多味藥材炮制而成的丸劑[4]，成分中珍珠﹑朱砂﹑牛黃等清熱解毒，抑制病毒；檀香﹑沉香﹑降香等健脾化濕，理氣健運；訶子澀腸止瀉；麝香﹑西紅花等涼血活血，化瘀消癓[5]，特別是訶子為最常用藏藥，主要含單寧及多元酚類﹑三萜類﹑黃酮類等化學成分，這些成分具有抗菌﹑ 抗氧化﹑抗炎 ﹑抗過敏﹑降壓﹑清除自由基﹑抗衰老等作用。西藏自治區新型冠狀病毒藏醫藥防治方案中建議：預防﹑發病﹑治愈后期和康復期都可服用仁青常覺。目前仁青常覺在臨床上多用于治療陳舊性胃腸炎﹑潰瘍﹑萎縮性胃炎等癥狀，但未見在急性呼吸窘迫綜合征方面的現代藥理學研究報導。本研究通過 LPS 復制家兔 ARDS模型，觀察仁青常覺療效并初步探索其作用機制。

材料與方法

1 動物分組及模型制備

健康雄性新西蘭大白兔36只，體重（2.00±0.2）kg，由成都達碩生物科技有限公司提供；內毒素（LPS）由北京博奧拓達科技有限公司提供，批號：12181202L2630；地塞米松由上海源葉生物科技有限公司提供，批號：S28D10B107184；仁青常覺由西藏甘露藏藥股份有限公司提供，批號：200400302。

實驗動物隨機分為六組：正常組，模型組，地塞米松組（3mg·L-1），仁青常覺高中低劑量組（150mg·L-1﹑50mg·L-1﹑17mg·L-1），每組各6只。正常組 及模型組每天灌胃動物飲用水，其它四組灌胃對應藥物，連續灌胃五天。實驗前12h禁食﹑禁水，20%烏拉坦（5ml·kg-1）耳緣靜脈注射麻醉，分離頸動脈做動脈插管連接生理監測儀，分離氣管插入導管；分別記錄0h﹑0.5h﹑1h﹑2h﹑4h時動脈壓，呼吸頻率，肛溫和采血進行動脈血氣分析。除正常組外，其余各組耳緣靜脈緩慢推注 LPS（750ug·kg-1），復制ARDS模型。

2 樣本采集及指標檢測

在相應時間點從兔頸內動脈采集動脈血，檢測其動脈血氧分壓（PaO2）并計算氧合指數（PaO2/FiO2），在4h結束后放血處死實驗動物，快速取出肺組織，分離左下肺葉并稱取濕重，用濾紙吸去左肺表面水分及血液后置于烘干箱內（80 ℃ 48h）烘干后稱量干重，計算肺濕重/干重（W/D）比值。右下肺葉經過4%多聚甲醛固定后脫水﹑透明﹑石蠟包埋﹑切片，免疫組化測定備用。其余肺組織取出后立即凍存-80 ℃冰箱待測 TNF-α﹑IL-1β﹑IL-6﹑IL-8﹑SOD及MDA，測定時用組織勻漿器用預冷生理鹽水制成體積分數為10%的肺組織勻漿。

3 統計學方法

采用 spss 23.0統計分析軟件進行數據處理。計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間數據比較采用單因素 ANOVA 分析法，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 肺濕干重比值（W/D）

模型組與正常組相比，肺濕干重比值有明顯上升（P＜0.01）；地塞米松組﹑高劑量組﹑中劑量組與模型組相比，肺濕干重降低（P＜0.05）；低劑量組與模型組相比較，不具有統計學意義（P＞0.05）。結果表明：仁青常覺能抑制由LPS引發的肺水腫（見圖1）。

圖1 6組兔肺 W/D 比值比較

2 不同時間點兔血動脈血氧分壓和氧合指數結果

2.1 動脈血氧分壓（PaO2）結果 耳緣靜脈注射 LPS前，6 組家兔 PaO2無明顯差異（P＞0.05）。在注射 LPS后，正常組在實驗過程中 PaO2保持相對穩定。模型組在 0.5h 時 PaO2降至最低為 566.74mmHg，明顯低于正常組（P＜0.01），隨后逐漸開始呈上升趨勢，但一直處于較低水平。地塞米松組﹑高劑量組﹑中劑量組與模型組相比在給藥后同樣呈下降趨勢，其結果介于正常組與模型組之間（P＜0.05）；低劑量組與模型組相比較，不具有統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 6組兔不同時間 PaO2 變化情況（±s） mmHg

表1 6組兔不同時間 PaO2 變化情況（±s） mmHg

模型組與正常組相比##P＜0.01，#P＜0.05；給藥組與模型組相比**P＜0.01，*P＜0.05。

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2.2 動脈血氧合指數（Pa02/Fi02）的結果 耳緣靜脈注射 LPS 前，6 組家兔 Pa02/Fi02 無明顯差異（P＞0.05）。在注射 LPS 后，正常組在實驗過程中保持相對穩定。模型組 Pa02/Fi02 明顯下降（P＜0.01），0.5h 降至最低，均數為243.11（＜300，符合 ARDS輕度標準），之后開始上升；地塞米松組﹑高劑量組﹑中劑量組 PaO2/FiO2給藥后 0.5h 至 1.0h 稍有下降但其下降趨勢小于模型組，與模型組比較有明顯差異（P＜0.05）；低劑量組與模型組相比較，不具有統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 6組兔不同時間 PaO2/FiO2 變化結果（±s） mmHg

表2 6組兔不同時間 PaO2/FiO2 變化結果（±s） mmHg

模型組與正常組相比##P＜0.01，#P＜0.05；給藥組與模型組相比**P＜0.01，*P＜0.05。

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3 臨床指征（血壓﹑呼吸及體溫）變化

3.1 血壓（BP）變化 6組家兔在實驗前基礎血壓無明顯差異（P＞0.05）。正常組在整個實驗過程中血壓

變化不明顯，基本穩定。模型組在靜注 LPS 后，血壓明顯下降（P＜0.05），之后一直處于較低水平；給藥組血壓在給藥后同樣呈下降趨勢，其數值介于正常組與模型組之間（P＜0.05）。見表3。

表3 6組兔不同時間BP的變化（±s） mmHg

表3 6組兔不同時間BP的變化（±s） mmHg

模型組與正常組相比##P＜0.01；給藥組與模型組相比**P＜0.01，*P＜0.05。

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3.2 呼吸（RR）變化 實驗前各組動物之間呼吸頻率無明顯差異（P＞0.05）。整個實驗過程中，正常組動物呼吸頻率變化較平穩。模型組動物在靜注 LPS 后呼吸頻率明顯增快（P＜0.01），達到高峰值68.75，然后緩慢下降。給藥組動物呼吸頻率的變化介于正常組及模型組之間（P＜0.05）。見表4。

表4 6組兔不同時間RR變化（±s） times/min

表4 6組兔不同時間RR變化（±s） times/min

模型組與正常組相比##P＜0.01，#P＜0.05；給藥組與模型組相比**P＜0.01，*P＜0.05。

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3.3 體溫（T）變化 實驗前各組動物之間體溫無明顯差異（P＞0.05）。整個實驗過程中，正常組動物體溫變化較平穩。模型組動物在靜注 LPS 后體溫明顯增快（P＜0.01），達到高峰值39.19，然后緩慢下降。其他組動物體溫的變化介于正常組及模型組之間（P＜0.05）。見表5。

表5 6組兔不同時間 T 變化（±s） ℃

表5 6組兔不同時間 T 變化（±s） ℃

模型組與正常組相比##P＜0.01，#P＜0.05；給藥組與模型組相比**P＜0.01，*P＜0.05。

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4 兔肺細胞因子表達結果

模型組與正常組相比，肺組織中 TNF-a﹑IL-1β﹑IL-6﹑IL-8 顯著升高（P＜0.05）；地塞米松組與模型組相比 TNF-a﹑IL-1β﹑IL-6﹑IL-8 明顯降低（P＜0.05）；高劑量組與模型組相比 TNF-a﹑IL-1β﹑IL-6﹑IL-8明顯降低（P＜0.05），具有統計學意義；中劑量組與模型組相比 TNF-a﹑IL-1β﹑IL-6 均有不同程度下降（P＜0.05）；低劑量組與模型組相比 TNF-a﹑IL-1β 有下降趨勢（P＜0.05）。見圖2。

圖2 6組兔肺炎癥因子表達（pg/mL）

5 兔肺SOD﹑MDA表達

模型組與正常組相比，肺組織中 SOD﹑MDA 顯著升高（P＜0.05）；地塞米松組與模型組相比 SOD﹑MDA 明顯降低（P＜0.05）；高劑量組與模型組相比SOD﹑MDA 明顯降低（P＜0.05），具有統計學意義；中劑量組與模型組相比 SOD﹑MDA 均有不同程度下降（P＜0.05）；低劑量組與模型組相比 SOD﹑MDA 不具有統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 6組兔肺SOD﹑MDA表達

討 論

急性肺損傷（acute lung injury，ALI） 和ARDS這兩個概念在1994年歐美 ARDS 共識會議（AECC）中被提出。本次會議中認為 ALI 和 ARDS 是同一疾病發病過程中兩個不同階段，ALI 代表早期發病階段，而 ARDS 代表后期病情較嚴重階段，而且55% 的 ALI會在三天內進一步成為 ARDS。隨后《美國醫學會雜志》（JAMA） 在2012 年發表的柏林定義中決定取消ALI 的命名，將他們統一稱為 ARDS[6]。

本研究使用耳緣靜脈推注LPS（750ug/kg）的方法復制ARDS模型。注射LPS后，兔呼吸﹑體溫均有明顯上升，血壓呈持續下降趨勢，且 Pa02/Fi02明顯下降（P＜0.01），0.5h 降至最低，均數為243.11（＜300，符合 ARDS輕度標準），表明兔ARDS模型成功。

機體在感染 ARDS 后會產生大量的炎癥因子與介質，促使炎癥細胞在肺組織大量聚集，如中性粒細胞﹑巨噬細胞﹑淋巴細胞等。被炎癥反應激活的炎癥細胞導致 ARDS 獨有的“呼吸爆發（respiratory burst）”，并產生一系列連鎖反應，生成大量氧自由基導致血管通透性增加和微血栓[7]，促使炎癥反應更加嚴重。在ARDS疾病的發生過程中腫瘤壞死因子-α（TNF—α）﹑白介素-1β（IL-1β）﹑白介素-6（IL-6）﹑白介素-8（IL-8）等促炎癥細胞因子起著重要作用[8]。當大量炎癥因子和介質產生時會促使炎癥細胞在肺組織內聚集，其中就包括巨噬細胞，TNF-α 主要由活化的巨噬細胞產生。

本實驗發現仁青常覺可降低 TNF-α﹑IL-1β﹑IL-6﹑IL-8 水平，提高 SOD 活性﹑降低 MDA 水平，說明仁青常覺具有一定抑制炎癥因子釋放，以及清除自由基﹑抗缺氧的作用，來減輕 ARDS 時對肺臟的損傷。通過本實驗也間接驗證了仁青常覺新冠肺炎病人急性呼吸窘迫癥的保護作用。 但 ALI/ARDS 是由多種致病因素導致的肺功能嚴重損傷，并且發病速度快﹑致死率高，發病機制尚未完全確定，仁青常覺中有效的化學成分不清楚，大多數實驗仍然停留在消化系統方面，關于 ARDS 的治療在臨床上未得到推廣，仍然需要在此方面更加深入的研究和探討。

綜上所述，仁青常覺對家兔 ARDS 時肺的保護作用可能與抑制炎癥因子釋放﹑清除自由基﹑抗缺氧有關。