miR-146a在慢阻肺患者中的表達(dá)及其意義*

張星星，楊勤軍，王小樂(lè)，高雅婷，王勝，孫泰，李澤庚，

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230032

3 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)呼吸病防治研究所 安徽合肥 230031

我國(guó)慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）患病率﹑致殘率和病死率高，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重[1]。根據(jù)我國(guó)慢阻肺最新流行病學(xué)資料顯示，慢阻肺成人患病率達(dá)8.6%，患病人口接近1億，20～39歲年齡段患病率2.1%，而40歲以上年齡段患病率由之前的8.2%攀升至13.7%[2]。其關(guān)鍵特征是慢性氣道炎癥和黏液高分泌[3]。目前越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調(diào)節(jié)慢阻肺氣道炎癥反應(yīng)，尤其miRNA-146a已被研究證實(shí)可參與慢阻肺炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，并能負(fù)性調(diào)控炎癥因子分泌，已成為慢阻肺治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)[4-5]。本研究通過(guò)比較慢阻肺患者和正常人群外周血miR-146a的差異表達(dá)，探討慢阻肺發(fā)病機(jī)制。

資料與方法

1 研究對(duì)象

研究病例來(lái)源于2019年6月—2019年12月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科門(mén)診招募的慢阻肺穩(wěn)定期患者，嚴(yán)格按照納排標(biāo)準(zhǔn)篩選出40例慢阻肺穩(wěn)定期患者，設(shè)為慢阻肺組。并于本院體檢中心篩選20例健康狀態(tài)的正常人群作為正常對(duì)照組。

2 納入﹑排除標(biāo)準(zhǔn)

2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》慢阻肺穩(wěn)定期診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；年齡在40～75歲；既往3個(gè)月內(nèi)未服用激素類(lèi)藥物；未參加其他臨床研究；自愿參加本研究并簽署知情同意書(shū)（倫理委員會(huì)批件文號(hào)：2016AH-25）。

2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；合并嚴(yán)重心﹑肝﹑腎疾病者；合并支擴(kuò)﹑支氣管哮喘﹑肺結(jié)核﹑肺部腫瘤等其它肺部疾病者；合并風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病且近1個(gè)月內(nèi)曾用過(guò)免疫抑制劑等藥物者；合并精神疾病病史者；處于妊娠及哺乳期婦女者。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 收集血清 抽取2組空腹靜脈血，于本院臨床實(shí)驗(yàn)中心離心留取血清，-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 RT-qPCR 法檢測(cè)血清miR-146a mRNA表達(dá)水平用RNAiso（貨號(hào)9113）提取血清總RNA，取1μl RNA 樣品，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，純度為1.8-2.1。按照miRNA First Strand cDNA Synthesis （Tailing Reaction）（B532451）試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR體系用TB Green Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）染料，上游引物序列：AATTGAGAACTGAATTCCATGGGTT，下游通用引物由生工公司提供（具體序列公司保密），以U6作為內(nèi)參，Relative Quantification Study為分析方法，最終相對(duì)表達(dá)量取2-△△Ct。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用IBM SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較，因該篇數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性和方差齊性，故采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 2組一般資料

見(jiàn)表1。研究對(duì)象在性別﹑年齡一般資料方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 2組一般資料

2 2組對(duì)象血清miR-146a mRNA表達(dá)水平比較見(jiàn)表2。

表2 2組血清miR-146a mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 2組血清miR-146a mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。

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討 論

慢阻肺是一種常見(jiàn)的可以預(yù)防和可以治療的疾病，以持續(xù)存在的呼吸道癥狀和持續(xù)氣流受限為特征，常與有毒顆粒和/或氣體顯著暴露致氣道和（或）肺泡異常相關(guān)，炎癥仍是慢阻肺進(jìn)展的核心機(jī)制[7]。微小RNA（miRNA）是一類(lèi)廣泛存在于真核生物體內(nèi)的長(zhǎng)度約為21～25個(gè)核苷酸組成的進(jìn)化保守的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA[8]，可同時(shí)調(diào)節(jié)基因和基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)，能夠誘導(dǎo)信使RNA （mRNA）的降解，抑制mRNA的翻譯，是重要的基因調(diào)節(jié)因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在調(diào)節(jié)慢阻肺﹑哮喘和氣道重塑等不同炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且還發(fā)現(xiàn)miRNA在慢阻肺中的病理生理作用及其在疾病中的差異表達(dá)，參與慢阻肺的發(fā)病和發(fā)展，被證明是一種有效且有潛力的慢阻肺診斷的生物標(biāo)志物[10-11]。其中，miR-146a定位于第五號(hào)染色體的第二個(gè)外顯子區(qū)，是miRNA家族中序列高度保守的因子之一[12]。已被證實(shí)可參與慢阻肺炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制[13]，可通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式下調(diào)炎癥因子分泌[14]，降低IL-6﹑TNF-α等炎癥因子的水平[15]。研究表明miR-146a可抑制環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)，眾所周知COX-2是一種促炎趨勢(shì)誘導(dǎo)因子，其過(guò)表達(dá)是促進(jìn)慢阻肺發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[16]。而miR-146a也可通過(guò)調(diào)控COX-2的表達(dá)來(lái)影響慢阻肺的進(jìn)展[17]。并且，還有研究證明miR-146a還可調(diào)節(jié)慢阻肺的黏液高分泌狀態(tài)[18]。

綜上所述，miRNA-146a可參與調(diào)節(jié)慢阻肺的炎癥反應(yīng)，具有一定的抗炎作用，是一種有效且有潛力的慢阻肺診治新靶點(diǎn)。故本項(xiàng)目初步開(kāi)展了小樣本研究，比較了miR-146a在慢阻肺患者及正常人體血清中的差異表達(dá)，結(jié)果顯示慢阻肺患者血清中的miR-146a相對(duì)表達(dá)量低于正常人群，提示miR-146a在慢阻肺人群中呈現(xiàn)低表達(dá)水平，致其抗炎作用減弱，可能與其調(diào)控的炎癥通路相關(guān)。因本團(tuán)隊(duì)“慢性阻塞性肺疾病綜合管理平臺(tái)”的開(kāi)發(fā)周期尚短，正在逐漸完善當(dāng)中，故該研究的樣本量尚不充分，下一步繼續(xù)借助上述平臺(tái)，擴(kuò)大研究中心范圍，擬收集更多慢阻肺患者，篩選更多的樣本量，進(jìn)一步開(kāi)展慢阻肺的臨床研究，同時(shí)實(shí)施miRNA-146a調(diào)控的慢阻肺炎癥機(jī)制探討研究，為慢阻肺防治尋找新的策略。