基于網(wǎng)絡藥理學探討復方刺梨合劑抗胃癌作用機制及實驗研究

蔣正立 朱 萍 任 宇 戴淑萍 陳 靜

胃癌是一種常見消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌、腸癌和前列腺癌，而死亡率在所有癌癥死因中排第3 位，嚴重危害人類健康[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在胃癌治療方面效果明顯，從中草藥中尋找抗癌藥物的各類研究一直受到人們的廣泛重視。復方刺梨合劑是浙江省臺州醫(yī)院院內制劑，由刺梨與蒼術組成，具有健脾燥濕、消食和胃之功效，對食積不化、胃脘脹滿、泄瀉等具有明確療效。復方刺梨合劑抗胃癌作用尚未見報道，而前期文獻研究發(fā)現(xiàn)，刺梨與蒼術均對胃部腫瘤細胞有抑制作用[2-6]。網(wǎng)絡藥理學研究具有整體性和系統(tǒng)性，與中醫(yī)藥的辨證論治原則、整體觀念相合，可用于發(fā)現(xiàn)復雜中藥中的活性成分，進而識別靶標和預測適應證[7-9]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，預測和分析復方刺梨合劑抗胃癌藥理作用機制，并進行實驗初步驗證，為深入研究其胃癌治療作用提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器 化學發(fā)光/熒光成像分析儀（Image-Quant，LAS500 北京盛科信德），電泳儀（1658033，美國賽默飛），半干轉印槽（1703940，北京龍躍），高速冷凍離心機（AllegraX-15，美國貝爾曼）。

1.2藥物及試劑 復方刺梨合劑（浙江省臺州醫(yī)院制劑室，201026），組織細胞總蛋白抽提試劑盒（杭州達文生物，P1250-50），預染蛋白（杭州達文生物，P1101），麗春紅（杭州達文生物，P1503），1M Tris-HCl，pH6.8（杭州達文生物，B1002），pH8.0（杭州達文生物，B1011），ECL Plus 超敏發(fā)光液（杭州達文生物，P1052），封閉專用脫脂牛奶（杭州達文生物，P1622），Tween-20（上海生工生物工程，C500623），SDS（上海生工生物工程，A100227），Glycine（上海生工生物工程，A110167），SAGE 配膠試劑盒（杭州達文生物，AP014），5X loading buffer（杭州達文生物，B1034-5），Bcl-2 抗體（杭州達文生物，C1342），p53抗體（杭州達文生物，C1831），HRP-抗兔二抗（杭州達文生物，C2252），磷酸鹽緩沖液（PBS），胃癌細胞株SGC-7901（中國科學院）。

1.3方 法1.3.1 活性成分篩選 以“刺梨”與“蒼術”為主題詞，從中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）（http∶//tcmspw.com/index.php）中尋找與這2 味中藥相關的所有化學成分及對應靶點，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為化合物分子篩選條件，通過條件篩選，即為候選活性成分。

1.3.2活性成分-靶點篩選 基于TCMSP 查找活性成分靶點，同時登陸SwissTarget Prediction http∶//www.swisstargetprediction.ch/）服務器，上傳復方刺梨合劑活性成分Sdf-mol 格式文件，采用反向藥效團匹配方法，設置可能性Probability＞0，得到虛擬活性成分對應靶點。

1.3.3抗胃癌作用靶點篩選及PPI 網(wǎng)絡構建 以“gastric cancer”等關鍵詞搜索比較毒物遺傳學數(shù)據(jù)庫（CTD）（http∶//ctdbase.org/）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）（http∶//www.omim.org/）中已報道的胃癌相關靶點，選擇既是活性成分靶標又是胃癌靶標的蛋白進行分析，篩選靶標。通過Cytoscape 3.7.1 軟件構建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖。將復方刺梨合劑抗胃癌治療的潛在關鍵靶點基因導入String 數(shù)據(jù)庫平臺（https∶//string-db.org/），選擇物種為人類，獲取蛋白質相互作用關系，繪制蛋白關系網(wǎng)絡。

1.3.4GO 功能和KEGG 通路分析 采用WebGestalt（http∶//www.webgestalt.org/option.php）和DAVID 數(shù)據(jù)庫（https∶//david.ncifcrf.gov/）對預測治療靶點進行GO功能分析和KEGG 通路分析。

1.3.5實驗研究 基于網(wǎng)絡藥理學，采用Western blot 法測定p53、Bcl-2 蛋白表達。取人胃癌細胞株SGC-7901，接種于10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)前期預實驗結果將細胞分為對照組及實驗組（濃度分別為80、120、160、240、320μg/mL）。收集對數(shù)生長期細胞，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于6 孔板中，每孔2mL。按分組濃度添加含藥培養(yǎng)基，每組設3 個復孔，于37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)48 和72h。用0.25%胰酶消化收集細胞，并用預冷PBS 洗滌2 次。用1mL RIPA 裂解液于冰上提取蛋白，以12000r/min 離心15min，取上清液。蛋白質濃度測定后，以40μg/孔的上樣量進行蛋白質電泳，半干轉膜法將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉2h。TBST 溶液洗滌PVDF 膜3 遍后，于4℃條件下孵育p53 及Bcl-2 抗體搖動過夜，洗脫一抗后孵育二抗，于避光條件下采用增強化學發(fā)光法（ECL）分析系統(tǒng)顯影，并用ImageJ 軟件計算分析條帶灰度值。

1.3.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用One-way ANOVA 進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1活性成分 以“蒼術”為關鍵詞，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中得到蒼術活性成分49 個化學成分，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18 進行篩選，得到4 個活性成分，分別是NSC63551、谷甾醇-3-O-葡萄糖苷、漢黃芩素、3β-乙酰氧基蒼術酮。而TCMSP 數(shù)據(jù)庫中并未收錄刺梨，通過文獻檢索相關成分，包括黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）、維生素C、三萜以及多糖等活性成分，進一步將其成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18 進行篩選得到3 個活性成分（槲皮素、山奈酚、木犀草素）。此外，維生素C、蘆丁和刺梨苷雖然不滿足OB≥30%或DL≥0.18，但含量較高，同時文獻研究表明，蘆丁具有抗胃癌SGC-7901 細胞作用[10-11]，維生素C 也具有抗胃癌作用[12]，因此納入活性成分，最后通過篩選共得到活性化合物10個，其中蒼術4 個，刺梨6 個，具體見表1。

表1 復方刺梨合劑篩選后得到10 個活性成分

2.2活性成分-靶點 篩選相關作用靶點，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https∶//www.uniprot.org/）的Uniprot ID對應至基因，共得到人源靶點基因236 個。

2.3復方刺梨合劑治療胃癌作用靶點篩選及PPI 網(wǎng)絡構建 以“gastric cancer”等關鍵詞搜索CTD 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中已報道的與胃癌相關的靶點，共得到440 個胃癌相關靶點，選擇既是成分靶標又是胃癌靶標的蛋白進行分析，共篩選到38 個靶標。通過Cytoscape3.7.1 軟件構建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖（見圖1），該網(wǎng)絡包含2 種藥物、1 種疾病、8 個活性成分、38 個靶點，連接度為前3 的潛在活性分子為quercetin、luteolin、kaempferol，關鍵靶點包括p53、Bcl-2、PIK3CA、Caspase8、CDK4 等。以上成分及靶點是復方刺梨合劑抗胃癌治療的重要成分及重要靶點，對復方刺梨合劑治療胃癌有重要意義。將38 個潛在的關鍵靶點基因導入String 數(shù)據(jù)庫平臺，繪制蛋白關系網(wǎng)絡（見圖2），該網(wǎng)絡圖共包括38 個節(jié)點，397 條邊。其中綜合數(shù)值評分＞0.995 的相互作用蛋白有CDK4-CCND1、CDKN1A-CDK4、BCL2L1-TP53、CDKN2A-CDK4、CDKN1A-CCND1、CDKN1A-TP53、MAPK8 -JUN、CASP8 -BCL2L1、PLAU -SERPINE1、CHEK2-TP53 等，這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡中具有重要地位，靶點基因在復方刺梨合劑抗胃癌治療中具有重要意義，可作為復方刺梨合劑有效成分作用的靶點基因。

圖1 復方刺梨合劑藥物、活性成分與胃癌關鍵靶點網(wǎng)絡

圖2 蛋白質關系網(wǎng)絡圖

2.4GO 功能和KEGG 通路分析 采用WebGestalt和DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能和KEGG 通路分析。如圖3 所示，GO 功能分析顯示顯著功能有：對刺激反應（38/38）、生物調節(jié)（38/38）、細胞傳遞（36/38）、核（28/38）、胞質溶膠（25/38）、膜封閉腔（25/38）等。KEGG 通路富集結果顯示，38 個靶點參與63 條顯著KEGG 通路（根據(jù)Benjamini 校正法、PValue＜0.01），包括關鍵基因靶點主要富集的通路為HIF-1 信號通路、p53 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。且與胰腺癌、膀胱癌、大腸癌、子宮內膜癌、小細胞肺癌等腫瘤密切相關，表明復方刺梨合劑的活性成分靶點分布于不同的通路，可通過各通路協(xié)調發(fā)揮抗癌作用。同時復方刺梨合劑的關鍵靶點基因富集于多種癌癥通路上，提示此類型的癌癥可作為未來研究復方刺梨合劑對抗癌療效的重要方向。

圖3 GO 功能分析結果

2.5實驗研究 與對照組（0.28±0.02）比較，80μg/mL復方刺梨合劑處理48h 后，人胃癌細胞SGC-7901中p53 蛋白相對β-actin 表達量為（0.38±0.03，P=0.060），160μg/mL 和320μg/mL 復方刺梨合劑處理48h 后，p53 蛋白相對β-actin 表達量分別為（0.60±0.05，P=0.011）和（0.47±0.01，P=0.005）。與對照組（0.09±0.01）比較，80μg/mL 復方刺梨合劑處理48h后Bcl-2 相對β-actin 表達為（0.13±0.00，P=0.005），160μg/mL 和320μg/mL 復方刺梨合劑處理組的Bcl-2 相對β-actin 表達量分別為（0.10±0.01，P=0.771）和（0.11±0.01，P=0.127）。Western blot 實驗結果顯示（見圖4），復方刺梨合劑使用后，p53 和Bcl-2 蛋白表達增加，且p53 相對β-actin 表達隨著復方刺梨合劑濃度的增加而增加。

圖4 p53 和Bcl-2 蛋白表達

3 討論

復方刺梨合劑作為醫(yī)院制劑，由刺梨與蒼術組成，該配伍利用刺梨味甘性涼，結合蒼術味辛性溫之性味，發(fā)揮其燥濕健脾、祛風散寒之功效。目前對其研究也局限于制劑質量控制方面[13-14]，而關于其藥理作用研究報道較少。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及文獻篩選了10 個復方刺梨合劑的活性化學成分，得到236 個化合物靶點，蒼術活性化學成分中漢黃芩素活性最高，作用于45 個靶點，刺梨活性化學成分中以槲皮素最高，作用于154 個靶點。通過CTD和OMIM 數(shù)據(jù)庫中已報道的與胃癌相關的靶點，共得到440 個胃癌相關靶點，對蛋白進行分析，共得到38 個靶標，關鍵靶點包括p53、Bcl-2、PIK3CA、Caspase8、CDK4 等。在本研究中，采用WebGestalt 和DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能和KEGG 通路分析，篩選出HIF-1、p53、TNF、PI3K-Akt 等信號通路，表明復方刺梨合劑可通過調控各通路發(fā)揮抗癌作用。基于網(wǎng)絡藥理學研究結果，p53 和Bcl-2 為復方刺梨合劑抗胃癌的關鍵靶點。p53 基因是目前研究最深入、最廣泛的腫瘤抑制基因之一，由11 個外顯子和10個內含子組成，是一種負調節(jié)因子，其失活對腫瘤形成起重要作用，在臨床中具有重要意義[15]。Bcl-2 基因為凋亡抑制基因，可通過阻礙細胞凋亡、促進細胞增殖、延長細胞壽命來增加腫瘤的發(fā)生，并促進腫瘤的發(fā)展[16]。不少學者研究表明，p53 在胃癌組織中高表達，與胃癌腫瘤直徑、淋巴結轉移、浸潤深度、胃癌TNM 分期等密切相關，其異常表達表明p53 與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移等有關[17-18]。多項研究顯示，胃癌中Bcl-2 蛋白高表達參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。因此，本研究采用Western blot 方法對網(wǎng)絡藥理學研究結果進行實驗驗證，結果表明，復方刺梨合劑可上調人胃癌細胞SGC-7901 中p53 和Bcl-2 蛋白表達。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡藥理學方法及實驗研究，揭示了復方刺梨合劑抗胃癌作用是多成分、多靶點、多通路的結果，可能通過調控p53 和Bcl-2 蛋白的表達發(fā)揮作用，為下一步深入研究其作用機制提供了思路。