鏈脲佐菌素聯合單側腎切除手術誘導糖尿病腎病大鼠模型的建立和評價及當歸補血湯的干預作用

王旭，馬艷春，趙良友，樸成玉，代浩然，劉靜，吳修紅

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是由糖尿病引起的慢性腎臟疾病，是糖尿病常見的微血管并發癥之一[1]，也是導致終末期腎衰(ESRD)的首要病因[2]，因此，DN的早期防治已成為亟待解決的臨床問題。近年來，隨著人們對DN的發生發展認識的不斷深入，對其治療藥物的研究也在不斷增加。在藥物有效性研究中，建立適當的動物模型，可以為研究疾病的病因、發病機制以及病理、生理改變提供線索，也可為臨床治療提供理論依據[3]，因此實驗動物模型已成為最常用和最可靠的工具之一[4]。目前常用DN模型多為自發病模型、轉基因模型、化學藥物損傷模型等。既往研究表明，這些動物模型存在操作及制備技術難度大、飼養條件較為苛刻、價格貴且不易獲得、成模率相對較低、模型穩定性差等問題[5]，并不完全適合應用在糖尿病腎病的研究中。本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)聯合單側腎切除手術，并給予脂肪乳誘導糖尿病腎病大鼠模型建立的方法，對構建動物模型的存活率、穩定性進行評估，以便為后期深入研究DN的發病機制以及干預、治療DN藥物研發提供參考和依據。

中醫將DN歸于“消渴”“水腫”“尿濁”“腎勞”等范疇，氣虛血瘀是DN的核心病機，治宜益氣養陰、健脾補腎、清熱解濁、活血化瘀[6-7]。當歸補血湯始載于《內外傷辨惑論》，為金元時期李東垣所著益氣補血經典名方[8]，方中黃芪味甘微溫，善于補虛益氣，能補五臟諸虛[9]；當歸甘辛而溫，養血和營，乃“血中之圣藥”[10-11]，二者合投，則氣血同調，共奏益氣活血之功效，切中DN病因病機，與其治則相吻合[12]。本研究選用對腎臟有保護作用的AngII受體拮抗劑藥物厄貝沙坦為陽性藥物，通過血糖、尿量、 尿白蛋白/肌酐比值、血液及腎臟病理組織學檢查等指標的改變，初步探討當歸補血湯對本研究中建立的DN模型大鼠的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購買于遼寧長生生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001，飼養于屏障系統內。模型建立期間給予脂肪乳及維持飼料，模型建立成功后給予維持飼料。本研究的受試動物獲得黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 試劑、藥物及制備

鏈脲佐菌素(STZ)，批號：2196，BioFrosxx；厄貝沙坦，批號：CA236，Sanofi Clir SNC；注射用青霉素鈉，批號：20120325-1，哈藥集團。

當歸、黃芪均購于北京同仁堂藥店(哈爾濱店)。經典名方當歸補血湯依照本草考證，分別按黃芪當歸5∶1取當歸補血湯藥材1 200 g，經水浸泡、煎煮、過濾、加水、再煎煮，合并兩次濾液，濃縮的藥液置于4 ℃冰箱中備用。

脂肪乳的制備：稱取豬油160 g,加熱使其融化，稱取膽固醇20 g，甲基硫氧嘧啶4 g，量取吐溫-80 160 mL，依次加入燒杯并充分攪拌均勻，即為油相。稱取谷氨酸鈉1 g，果糖5 g，蔗糖5 g置于燒杯中，加入無菌水60 mL,溶解后，再加入1，2-丙二醇60 mL,混勻，即為水相。均勻混合油相與水相后即可使用。制備模型的受試動物每日灌胃脂肪乳10 mL/kg。

1.3 主要儀器

顯微鏡(型號：CX31，OLYMPUS)；全自動生化分析儀(型號： C311， 羅氏 )；血糖測試儀(型號：HEA-232型，歐姆龍)；尿液分析儀(型號：URIT-560，優利特)；全自動血液分析儀(型號： XT-2000I，希森美康)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型的建立

本研究采用高脂飲食+STZ+單腎切除復制DN大鼠模型，主要方法如下：選取80只SPF級SD雄性大鼠，于屏障系統內適應性飼養1周。對照組(40只)給予維持飼料，其余動物持續灌胃給予脂肪乳4周，灌胃給予脂肪乳2周后進行單腎切除手術，恢復1周后大劑量腹腔注射1次STZ(40 mg/kg)。

單側腎切除手術方法：腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液，待受試動物麻醉后，腹部去毛消毒，在平行于腎臟的腹部中線位置剪開2 cm左右的切口，游離出右腎，用止血鉗夾住其遠端血管，用可吸收線進行結扎，祛除腎臟并縫合傷口，每只受試動物肌注青霉素鈉2萬U，2次/日，連續1周。

動物模型驗證：造模結束72 h后測尾靜脈血糖，以隨機血糖(randomplasmaRBGcose，RPG)≥16.7 mmol/L為糖尿病模型成立標準，7 d后再次檢查RPG，結果穩定的受試動物確定為DN大鼠模型成立。評估糖尿病模型是否成功，記錄死亡動物數量。當DN大鼠模型成功后，時間設為0點，繼續觀察4、6、8周。

按照隨機分組的方法，模型評價實驗分為對照組、0周組、4周組、6周組及8周組，其中對照組給予維持飼料，其余組給予脂肪乳及維持飼料，自由飲食；當歸補血湯干預實驗分為對照組、DN模型組、當歸補血湯組(DBD組)、厄貝沙坦組，每組10只，均給予維持飼料。

1.4.2 當歸補血湯干預方法

DBD組灌胃給予4.2 g/kg的當歸補血湯，灌胃體積為0.1 mL/10 g，對照組及DN模型組給予等體積的蒸餾水，給藥期分別為4、8周，給藥期間記錄動物一般狀態；實驗期結束后，進行檢測相關指標、取材。

1.4.3 檢測指標

稱取所有受試動物的各時間點體質量、單側腎臟重量，并計算單腎體比。取尿液，檢測所有受試動物各時間點的尿白蛋白(Urine albumin)及尿肌酐(Urine creatinine)，并計算尿白蛋白與尿肌酐的比值(UACR)；取血清或全血，檢測所有受試動物各時間點的總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)、隨機血糖(RPG)等指標。

1.4.4 病理學檢查

取出各組大鼠同一側腎臟，用甲醛固定液固定保存。固定一周后進行修塊，再置于包埋框中再次固定12 h。固定好的組織依次進行脫水、透明、石蠟包埋；包埋后的組織使用切片機進行5 μm石蠟切片、撈片、過夜烘片，切片置于自動染色機進行HE染色，于封片機中封固后，采用光學顯微鏡進行腎臟組織病理變化的檢查。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 DN模型制備

2.1.1 體質量與攝食量情況

對照組大鼠在模型建立期間體態正常，活動自如，毛發光澤，體質量增長正常，食欲良好；如表1所示，造模組大鼠的體質量在造模第2周開始增長緩慢，與對照組比較，第3、4、5周的體質量顯著降低(P<0.01)；造模組大鼠的攝食量在造模第3周開始降低，與對照組比較，第3、4、5周的攝食量顯著下降(P<0.01)。

表1 造模期間大鼠攝食量與體質量的變化

2.1.2 成模率

造模組共40只大鼠，單側腎切除手術中，死亡2只；STZ注射后，死亡1只；按照隨機血糖(randomplasmaRBGcose，RPG)≥16.7 mmol/L為的標準，3只大鼠未合格，予以剔除。成模率為85%。

2.2 DN模型穩定性

2.2.1 一般狀況及腎體比

對照組大鼠在成模期間體態正常，體質量平穩增長，活動自如，毛色光澤，食欲良好；模型組大鼠一直伴有多飲多食多尿且少體質量的糖尿病典型癥狀，且皮毛蓬松，活動減少；如表2所示，在成模的各個時期，與對照組比較，模型組的體質量均顯著降低(P<0.01)，且呈下降趨勢，模型組的攝食量均顯著升高(P<0.01)，且呈上升趨勢，模型組的尿量及腎體比均顯著升高(P<0.01)，并保持平穩上升。

表2 成模期間大鼠尿量與腎體比的變化

2.2.2 腎臟及血液指標

與對照組比較，模型組受試動物的UACR、UREA、TG、CHOL、RBG等指標均有顯著升高(P<0.01)，且隨著成模時間的增加，模型組以上各個指標均有平穩上升，見表3。

表3 各組大鼠UACR及血液生化學指標的變化

2.3 當歸補血湯對DN大鼠模型的干預作用

2.3.1 一般狀況

對照組的受試動物在給藥前與給藥期間，步態正常，活動自如，被毛有光澤，食欲良好、糞便顏色正常、體質量增長正常，無死亡動物。給藥前，各個模型組的受試動物出現多飲多食多尿及低體質量，有活動減少、被毛蓬松等癥狀。給藥期間，DN組受試動物出現體型消瘦嚴重、被毛雜亂無光澤、尿量明顯增加等癥狀，在干預4周及8周實驗中分別死亡2只、3只。DBD組的受試動物體質量有所改善，活動增加，且給藥8周的受試動物體態好于給藥4周的受試動物，尿量依舊較多，相對少于DN組受試動物的尿量，無死亡動物。

2.3.1 當歸補血湯對DN大鼠模型的體質量及腎體比的影響

當歸補血湯干預給藥4、8周后，DN模型組的體質量與對照組比較均有明顯下降(P<0.01)，腎體比與對照組比較均有明顯增加(P<0.01)；與DN模型組比較，DBD組、厄貝沙坦組的體質量均有所升高(P<0.05)，與DN模型組比較，DBD組、厄貝沙坦組的腎體比均有所下降(P<0.05，P<0.01)；DBD組的體質量與腎體比與厄貝沙坦組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 當歸補血湯對大鼠體質量及腎體比的影響

2.3.2 當歸補血湯對DN大鼠模型的UACR及血液生化學指標的影響

當歸補血湯干預給藥4、8周后，與對照組比較，DN模型組的UACR、UREA、TG、CHOL、RBG均有不同程度的增高(P<0.01，P<0.05)；與DN模型組比較，DBD組的UACR、UREA、TG、CHOL、RBG均有不同程度的降低(P<0.01，P<0.05)，厄貝沙坦組的UACR及UREA均有不同程度的降低(P<0.01，P<0.05)，厄貝沙坦組的TG、CHOL、RBG差異均無統計學意義；與厄貝沙坦組比較，DBD組的UACR、UREA差異無統計學意義，見表5。

表5 當歸補血湯對大鼠UACR及血液生化學指標的影響

2.3.3 病理組織學檢查

如圖1所示，對照組腎臟組織未見異常，腎小管上皮細胞大小正常，排列整齊，無明顯的細胞增殖，腎小囊結構完整，輪廓清晰，腎小球形狀規則，無肥大或萎縮。當歸補血湯干預4周實驗中，DN模型組大鼠腎臟組織腎小管變性壞死，腎小管上皮細胞核腫脹，炎性細胞浸潤嚴重，DBD組腎小球輕微腫脹、血管充血，腎小球囊腔變小，厄貝沙坦組腎小管上皮細胞輕度萎縮；當歸補血湯干預8周實驗中，DN模型組大鼠腎臟組織腎小管上皮細胞變性萎縮，DBD組腎小管上皮細胞伴有輕度變性萎縮，厄貝沙坦組腎臟組織未見異常。各組受試動物腎組織病理學檢查從正常到病變的嚴重程度依次為對照組、厄貝沙坦組、DBD組、DN模型組，且病變程度隨著干預時間的增加而減弱。

注：A.對照組；B.DN模型組；C.DBD組；D.厄貝沙坦組；1.干預4周；2.干預8周。圖1 當歸補血湯干預的不同組大鼠腎組織HE染色(×200)

3 討論

DN的發病機制復雜，目前認為可能與線粒體功能紊亂，炎癥反應及氧化應激等有關[13-14]。近年越來越多的研究結果顯示，在病理狀態下，脂肪組織可異位沉積于非脂肪組織，導致異位脂肪沉積，引起脂代謝紊亂[15]。糖尿病狀態下，體內游離脂肪酸(FFA)氧化分解異常，引起腎臟脂代謝紊亂[16]，進而通過多種途徑引起腎臟的功能細胞損傷，促進 DN 發生發展。DN相關藥物研究中常用的動物模型為腹腔注射STZ誘導的糖尿病(DM)模型，使其自發形成糖尿病并發癥—糖尿病腎病，但是缺點是成模時間長，成模率低，不能很好地適用于DN研究[17]。本研究以灌胃脂肪乳結合腹腔注射STZ，模擬高糖、高脂狀態，聯合單側腎切除手術，加速DN形成過程，減少造模時間，節省實驗成本的同時，可以提高成模率。在本研究造模的第2周，體質量開始呈下降趨勢，分析是由于進行單側腎切除術手術后，對實驗動物創傷較大，結合攝食量的減少導致多數體質量下降。在造模過程中死亡3只大鼠，其中單側腎切除手術死亡2只，分析是手術過程中，對腎臟結扎不夠牢固，導致實驗動物失血過多死亡，應提高手術操作技能，減少動物死亡數量；在注射STZ后死亡1只，可能由于注射后實驗動物短期低血糖，導致動物死亡，可在腹腔注射后第一天的飲水里適量加入蔗糖，并及時給予飼料，或改為連續兩次注射小劑量注射STZ，以減少動物死亡數量，提高成模率。DN模型制備成功后，在對模型的連續觀察的8周過程中，模型組持續出現多飲多食多尿且高血糖的糖尿病癥狀，且癥狀持續穩定，UACR、UREA的水平隨著時間的增加，嚴重程度也逐漸增加；由于脂肪乳的給予，動物模型的TG、CHOL水平較對照組明顯升高，但由于成模后并未繼續給予脂肪乳，動物模型的TG、CHOL水平基本保持不變。通過以上實驗結果說明，本研究通過灌胃脂肪乳及腹腔注射STZ聯合單側腎切除手術建立的DN大鼠模型，具有成模率較高，死亡率低，DN癥狀的穩定性、持續性較好的特點，更適用于需長期用藥，且通過改善脂代謝紊亂減緩DN發生發展的相關中藥研究。

在課題組的前期研究中發現，當歸補血湯可改善氣血雙虛DN大鼠的腎功能，對腎臟具有保護作用[18]。結合當歸補血湯可調節大鼠的血脂水平及臨床上改善DN病人血脂水平的文獻報道[19-20]，課題組對當歸補血湯作用于本研究中建立的DN模型的血液生化學及腎功能相關指標進行了初步的探討。結果表明，本研究中的DN大鼠模型通過當歸補血湯的干預可降低血糖、調節血脂，改善腎功能，起到改善腎組織損傷的作用，從而有效控制DN的發展。但本研究也存在些許不足，由于厄貝沙坦是通過降低血壓減少尿蛋白和延緩腎功能惡化，從而起到腎臟保護作用，并無降低血糖及血脂的作用，因此在當歸補血湯對大鼠血液生化學指標的影響中，出現了厄貝沙坦組受試動物的TG、CHOL、RBG等指標與模型組比較無統計學差異的結果，在之后的研究中，應選擇厄貝沙坦結合具有降血糖血脂的藥物作為陽性藥，提高實驗的精確度。由于初步探討當歸補血湯的干預作用，只設計了一個給藥劑量，應增加實驗劑量組，更好地確定當歸補血湯的有效作用劑量，并對其降低尿白蛋白排出及血脂水平的相關分子機制進行深入研究，對中醫藥早期干預和延緩DN的進展具有積極的意義。