叉頭蛋白p3基因rs3761548多態性與1型糖尿病的相關性*

喬彥 趙景宏 劉濤 孫娜 王曉娟

(南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院 1.內分泌科；2.心血管內科,四川 南充 637000)

1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus, T1DM)是一種慢性器官特異性自身免疫性疾病，發病率呈全球上升趨勢，患者需終生依賴胰島素治療維持生命，給社會和家庭帶來沉重的負擔[1-3]，所以T1DM的防治顯得尤為重要。T1DM主要是在遺傳易感基因的基礎上，由自身抗原特異性、致病性T淋巴細胞介導的免疫損傷造成胰腺b細胞進行性破壞導致胰島素絕對缺乏而致病，但具體機制尚未闡明[4-5]，而免疫和遺傳學易感因素越來越引起人們的重視。調節性T細胞(Regulatory T cell, Treg)是一類在調節機體免疫應答和維持免疫穩定的過程中具有重要作用的CD4 T細胞群，有著天然的免疫抑制功能[6-7]。Treg細胞減少或抑制功能下降，會導致起某些包括T1DM、腫瘤、移植排斥等免疫相關疾病發生[8-10]。叉頭蛋白 p3(Forkhead box p3，Foxp3)是Treg細胞最特異性的轉錄因子，獨特表達于Treg細胞，對Treg細胞的分化發育和功能建立非常重要，其突變、缺陷或者表達異常會導致機體內免疫穩態失衡，引發自身免疫性疾病[11-12]。動物研究及患者樣本研究發現，TIDM存在Foxp3+Treg數量和功能受損，修復或替代T1DM患者體內的Treg可能逆轉自身免疫并保護殘余b細胞功能[13]。有研究證實，與Foxp3+Treg細胞功能密切相關的基因單核苷酸多態性會影響Foxp3+Treg的功能[14]。不同種族和地域的人群的單核苷酸多態性分布規律及等位基因頻率是不同的，而Foxp3基因多態性與中國漢族人群T1DM的敏感性卻鮮有研究。本研究旨在探討川北地區漢族人Treg細胞轉錄因Foxp3基因啟動子區域-3279(C→A)位點rs3761548多態性的基因頻率分布及其與T1DM的相關性，為探討川北地區漢族人T1DM發病的分子遺傳基礎提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年4月～2020年9月我院內分泌科收治的180例經典T1DM患者為T1DM組。納入標準：①符合世界衛生組織制定的糖尿病診斷及分型標準。②均為漢族。排除標準：①繼發性、其他特殊類型糖尿病。②合并急性并發癥、妊娠、嚴重高脂血癥及心、肺、肝、腎等主要臟器嚴重疾患。③合并其他類型的自身免疫性疾病。④合并惡性腫瘤。另隨機選取同期本地區無血緣關系的我院健康體檢者186名為對照組，經詢問病史和體檢，排除心、肺、肝、腎及內分泌疾病、自身免疫性疾病及家族史等，口服糖耐量試驗結果正常，均為漢族。本研究經醫院倫理委員會審核同意。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA的分離及聚合酶鏈反應 抽取空腹12～14 h 靜脈血1 mL，EDTA 抗凝。按微量DNA全血提取法提取基因組DNA，-20℃保存備用。PCR擴增引物由北京百泰克公司合成。引物1為 5′-CCT CTC CGT GCT CAG TGT AG -3′，引物2為 5′-GCC TCA GCC TTC GCC AAT A-3′。PCR反應總體積25 μL，含0.5 μmol/L 引物，200 μmol/L dNTP，25 mmol/L MgCl2，0.2 μg DNA 模板，2.0 U Taq DNA 聚合酶。反應在DNA熱循環儀上進行，PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35次；72℃延伸5 min結束反應。用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測特異性PCR擴增產物。

1.2.2 基因分型 PCR擴增產物送北京三博遠志生物技術有限公司，采用質譜法完成進行基因分型。

1.2.3 臨床資料收集與生化指標檢測 由專業調查醫師登記研究對象的一般資料、現病史、既往史、家族史、診療過程等，測量身高、體重，計算體質指數(BMI)。酶法檢測空腹血糖(FPG)、餐后2小時血糖(2 h PG)、血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；化學發光法檢測空腹C肽(FCP)、餐后2小時C肽(2 h CP)；液相色譜法檢測糖化血蛋白A1c(HbA1c)。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 按公式 (TG<4.52 mmol/L ) 計算:LDL-C=TC-(TG/2.1+HDL-C)。

2 結果

2.1 兩組臨床及生化資料比較 T1DM組與對照組性別配比基本一致(P>0.05)。與對照組比較，T1DM組的年齡、BMI及HDL-C水平均顯著降低(P<0.05)，而HbA1C、FPG、2 h PG、TG、TC、LDL-C水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組臨床及生化資料比較

2.2 兩組Foxp3基因rs3761548基因型及等位基因頻率的比較 T1DM組和對照組的Foxp3基因rs3761548多態性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。rs3761548等位基因分布在兩組均以C等位基因為常見等位基因，A等位基因為少見等位基因。rs3761548多態位點A等位基因頻率為18.7%，等位基因C、A的頻率在T1DM組和正常對照組分別為80.8%、19.2%和81.7%、18.3%。兩組間基因型頻率和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組Foxp3基因rs3761548基因型和等位基因頻率分布[n(×10-2)]

2.3 不同遺傳模型下Foxp3基因 rs3761548 多態性與T1DM的相關性 本研究進一步分析了在超顯性模型、顯性模型、隱性模型及加性模型下Foxp3基因 rs3761548 多態性與T1DM易感的相關性，結果提示，在四種不同的遺傳模型下，Foxp3基因rs3761548位點的基因型分布在T1DM組和對照組之間無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 不同遺傳模型下Foxp3基因rs3761548多態性與T1DM的相關性

2.4 T1DM患者Foxp3基因 rs3761548 多態性不同基因型亞組臨床特征的比較 T1DM組Foxp3基因 rs3761548 位點不同基因型的患者的LDL-C、FCP及2 h CP水平存在差異(均P<0.01)。與CC基因型患者相比，A等位基因攜帶者AA+CA基因型的LDL-C水平更高，而FCP、2 h CP水平更低。rs3761548多態位點不同基因亞組之間BMI、HbA1C、TG、TC、HDL-C等指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 T1DM組 rs3761548 多態性不同基因型臨床及生化資料的比較

3 討論

T1DM是一種由T淋巴細胞介導的胰島b細胞破壞，從而引起血糖升高的代謝紊亂性疾病，由遺傳易感性和環境危險因素相互作用導致，全球患病率不斷上升，然而其發病機制目前尚未闡明[15]。研究表明，許多與免疫相關的遺傳變異，如人類白細胞抗原Ⅱ類基因、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4基因等均被證實與T1DM有關[16]。鑒于Treg細胞在免疫調節中的重要作用，本研究探討了Foxp3基因多態性與我國川北地區漢族人群T1DM的相關性。

Foxp3基因位于X染色體p11.23區域，是Treg細胞的標志性轉錄因子，恒定表達于Treg細胞上，與Treg細胞的發育和功能密切相關。Foxp3+Treg細胞分為天然型和誘導型，可以通過分泌細胞因子、耗竭IL-2、通過perforin通路抑制效應T細胞及降低ATP介導的前炎癥反應、抑制樹突狀細胞功能等多種分子機制起到免疫抑制的作用[17]。Foxp3+Treg細胞在1型糖尿病中表達下調，修復或替代T1DM患者體內的Treg可能逆轉自身免疫并保護殘余b細胞功能[18]。單核苷酸多態性是人類最為普遍的一種遺傳變異，可能使翻譯序列中某些氨基酸發生改變而影響蛋白質的生物功能甚至改變其生物性狀[19-20]。

本研究對我國366名漢族人群Foxp3基因 rs3761548 多態位點基因型分析顯示，在中國漢族人群中 rs3761548 多態位點A等位基因的頻率為18.7%，低于伊朗人群的61%[21]及土耳其人的56%[22]，顯示rs3761548 基因頻率存在明顯的種族差異性。T1DM組和對照組Foxp3基因 rs3761548 多態位點C、A等位基因頻率分別80.8%、19.2%和81.7%、18.3%，兩位點基因型頻率和等位基因頻率在T1DM組和對照組之間的分布差異均無統計學意義(P>0.05)。同時分別在超顯性模型、顯性模型、隱性模型、加性模型遺傳模型下，rs3761548位點基因型在兩組間分布差異無統計學意義，提示rs3761548多態位點與T1DM間沒有直接關聯。

rs3761548 的基因型AA和AC可能増加多種疾病的風險，如白癜風、銀屑病、Graves甲亢等[23-24]。我們進一步的基因型-表型關聯研究發現，Foxp3基因rs3761548 多態位點A等位基因攜帶者的FCP及2 h CP更低，而LDL-C水平更高，提示A等位基因攜帶者的T1DM進展及相關心血管并發癥的風險可能更高。El-Shabrawy等[25]研究發現低水平的Foxp3+Tregs與TIDM患者的LDL-C水平升高及心血管并發癥有關。

在這項研究中，我們評估了Foxp3基因的單核苷酸多態性rs3761548的可能作用，沒有發現所選單核苷酸多態性與T1DM風險之間的關聯，但是發現rs3761548 C→A的突變導致T1DM患者LDL-C水平更高，胰島功能更差。在今后的研究中，我們可以進一步擴大樣本量、關聯分析更多的SNP位點及進一步檢查Foxp3分子水平表達、Foxp3+Treg細胞水平等來研究Foxp3對T1DM的影響。

4 結論

Foxp3這一對免疫調節起重要作用的基因，其rs3761548多態性與T1DM沒有直接關聯，但 rs3761548位點A等位基因與我國川北地區漢族T1DM人群的LDL-C水平及FCP、2 h CP水平密切相關，提示Foxp3基因rs3761548位點與川北地區漢族人群T1DM患者的臨床特征相關。