miR-622 抑制物對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響研究

沈嚴嚴，文 南，湯 盼

（1.南華大學附屬南華醫院超聲科，湖南 衡陽 421002；2.南華大學衡陽醫學院，湖南 衡陽 421000）

乳腺癌（breast cancer）是除東非地區外，女性患者最常罹患的惡性腫瘤，也是全球11 個地區中因惡性疾病致死的最常見原因[1]。現如今乳腺癌的治療方法主要有放療、新輔助化療、手術切除、靶向生物治療等方式，但存在晚期轉移、復發的風險，以及化療藥物耐藥，給臨床治療帶來了巨大困難[2]。因此，需要深入研究乳腺癌發病機制，尋找治療乳腺癌的新通路、新靶點。微小RNA（microRNA，miRNA）通過與目標基因mRNA 互補結合負性調控mRNA 的穩定性或遏制其翻譯效率從而調控生命活動，是一串內源性單鏈非編碼RNA，其在乳腺癌中的致病作用機制的研究中已成為一大熱點[3]。miR-622 近來被廣泛報道是miRNA 家族中的主要成員，在多項研究中顯示miR-622 可調控癌癥相關通路抑制癌癥發展，是癌癥的抑制因子[4，5]。研究顯示[4-6]，miR-622 在胃癌、乳腺癌等癌癥中作用異常，而miR-622 在乳腺癌中起致癌還是抑癌作用仍存在爭議。miRNA 在腫瘤中的作用機制通常與多種蛋白有關[7]。Wang X等[8]報道顯示，miR-622 抑制K-Ras 的表達起抑癌作用。而生物信息學研究顯示miR-622 也與EYA1有預測的可能結合位點。miR-622 與EYA1 在癌癥中作用關系的研究尚不清楚，EYA1 是兼具有轉錄活性與磷酸酶活性的轉錄因子，最初在果蠅中被發現在調控眼睛形態發育中發揮重要作用。本研究采用qRT-PCR 檢測人乳腺癌細胞株MCF-7 中miR-622 的表達情況，通過miR-622 inhibitor 抑制miR-622 的表達后觀察癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的變化，以及乳腺癌細胞中EYA1 的表達情況，探討miR-622 在乳腺癌發生、發展中的可能作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人乳腺癌細胞系MCF-7 從南華大學附屬第一醫院臨床研究所獲取；雙抗、胎牛血清、胰酶、DMEM 培養基（美國Gibco 公司）；RIPA 細胞裂解液（上海雅吉生物科技有限公司）；Western blot試劑盒、BCA 試劑盒、HE 染色試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；GAPDH 一抗、EYA1 一抗、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（美國ABclonal 公司）；CCK-8 試劑盒、ECL 高效化學發光試劑盒（美國Genview 公司）；PVDF 膜（美國GE 公司）；預染蛋白marker（上海百賽生物科技有限公司）；通用型microRNA 提取試劑盒（北京金百特生物技術有限公司）；miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；DEPC 水（上海碧云天生物技術有限公司）；miR-NC、miR-622 inhibitor、Ribofactamine 試劑盒（廣州銳博生物技術有限公司）；Matrigel（美國BD公司Becton，Dickinson and Company）。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 取對數生長期乳腺癌MCF-7 細胞接種于6 孔板中，待細胞生長融合度達30%～50%時，根據制造商提供的說明，使用Ribofactamine 轉染試劑將miR-622 inhibitor、miR-NC 轉染到MCF-7細胞中。設為miR-622 inhibitor 組、miR-NC 組，另設control 組。將細胞放到37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養。24～36 h 后，利用倒置熒光顯微鏡觀測miR-622 的表達情況，并檢測轉染效率。

1.2.2 RNA 提取與qRT-PCR 檢測 根據RNA 提取試劑盒說明提取細胞系中總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA。合成特異性miRNA-622 引物和U6 內參引物。使用qRT-PCR 試劑盒進行檢測。反應程序：預變性95 ℃10 s；95 ℃5 s，40×；溶解曲線程序：95 ℃60 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s。完成定量后進行相對定量分析（2-△△Ct），得出miRNA-622 相對表達量。所有反應均進行3 次。

1.2.3 細胞增殖 根據說明用細胞計數試劑盒（CCK-8）檢測細胞增殖能力。轉染后，收獲穩定轉染的MCF-7 細胞，并以每孔5.0×103個細胞的密度接種到96 孔板上，在37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養12、24、48 和72 h 后，分別用20 μl CCK-8 試劑處理細胞，并在37 ℃條件下孵育2 h。使用多功能酶標儀測量450 nm 處的OD 值。所有實驗重復3 次。

1.2.4 細胞遷移 通過進行傷口愈合試驗來評估細胞遷移能力。轉染48 h 后，將對數生長期的MCF-7 細胞接種到6 孔板中，調整細胞濃度至2×105個/孔。待細胞生長融合度至80%～90%時，使用無菌的10 μl移液管尖端在每個孔的中心處劃傷。細胞劃傷后用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）洗去脫落的細胞，將剩余的細胞置于37 ℃培養12 h。在0 h 和12 h 分別用顯微鏡拍攝照片。對于每個圖像，劃痕兩側之間的距離使用ImageJ 軟件進行測量。細胞遷移實驗獨立進行3 次。

1.2.5 細胞侵襲 根據制造商的說明，在Transwell 小室（Becton，Dickinson and Company，USA）中評估MCF-7 細胞侵襲能力。將Matrigel 預先包被在Transwell 上室，然后將轉染48 h 后對數生長期各組細胞重懸于無血清培養基中，按照1×104細胞/孔的量接種在Matrigel 上。向下室中加入含有20%FBS培養基，置于37 ℃，5%CO2細胞培養箱培養24 h。用棉簽輕輕拭去上室的細胞和多余Matrigel 膠，4%甲醛固定10 min，PBS 清洗3 次后，根據HE 染色試劑盒染色。PBS 清洗后隨機選取5 個顯微鏡下視野觀察侵襲細胞數。

1.2.6 EYA1 蛋白檢測 采用Western blot 試劑盒檢測EYA1 蛋白表達水平。收集各組細胞，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白樣品進10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉PVDF 膜。封閉液封閉2 h 后，加入一抗EYA1（1∶5000 稀釋）或GAPDH（1∶5000 稀釋），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（1∶5000 稀釋），室溫孵育1 h。用ECL 高效化學發光試劑盒檢測條帶，采用ImageJ 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶吸光度，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達水平。實驗獨立進行3 次。

1.3 統計學分析 利用SPSS 21.0 數據分析統計軟件進行數據分析。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-622 inhibitor 轉染后細胞中miR-622 表達水平及細胞增殖情況 miR-622 inhibitor 組中miR-622 相對表達量為（0.53±0.07），低于control 組的（1.05±0.06）及miR-NC 組的（1.03±0.10），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1；CCK-8 實驗結果顯示，12 h 后，miR-622 inhibitor 組（0.41±0.23）增殖能力低于control 組（0.58±0.33）及miR-NC 組（0.55±0.31），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 各組細胞中miRNA-622 的表達情況

圖2 CCK-8 實驗檢測各組乳腺癌細胞中的增殖能力

2.2 miR-622 inhibitor 轉染后細胞遷移情況 miR-622 inhibitor 組遷移率（21.31±6.91）%低于control組（39.89±9.32）%及miR-NC 組（32.47±7.82）%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 細胞劃痕試驗測定各組乳腺癌細胞中的遷移能力

2.3 miR-622 inhibitor 轉染后細胞侵襲情況 control組（160.33±11.93）及miR-NC 組（160.33±11.02）侵襲細胞數高于miR-622 inhibitor 組的（125.00±11.53），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 Transwell 實驗檢測各組中乳腺癌細胞中的侵襲能力情況

2.4 miR-622 inhibitor 轉染后細胞中EYA1 表達水平 Western blot 研究結論顯示，miR-622 inhibitor組細胞EYA1 蛋白相對表達水平為（3.77±0.27），高于control 組的（1.04±0.04）和miR-NC 組的（0.97±0.07），差異有統計學意義（P＜0.05），提示miR-622可能調控EYA1 的表達，其中miR-622 呈負向調控，見圖5。

圖5 Western blot 檢測各組EYA1 蛋白的表達水平

3 討論

乳腺癌是全世界女性因癌癥致死的最常見原因，對乳腺癌的診療技術的探討仍是一大熱點。雖然目前通過手術切除、新輔助化療、放療、中醫和靶向治療等綜合方法，乳腺癌的發展得到一定緩解，但5 年總生存率仍然較低[1]。因此迫切需要了解乳腺癌的分子發病機制，從分子水平探討治療乳腺癌的可能性以及開發用于靶向治療藥物，對乳腺癌進行精準治療，提高患者生存率。miRNA 對腫瘤的調控作用越來越受到重視[7]。既往研究表明[8，9]，miRNA 影響了癌細胞的增值、轉移與侵襲，與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關。

miRNA 與靶基因信使RNA（mRNA）結合來調節mRNA，從而影響生命活動，參與疾病的發生發展[3]。既往研究顯示[10]，miR-622 位于人染色體13q31.3 區域，在多種腫瘤中異常表達，靶向調節不同信號通路在多種癌癥中發揮作用。但有關miR-622 在乳腺癌中的參與機理的研究甚少。本研究采用了在乳腺癌細胞中轉染miR-622 inhibitor 下調癌細胞中miR-622 后發現，與control 組以及miRNC 組比較，miR-622 inhibitor 組中癌細胞增殖、遷移和侵襲力均顯著減弱這一現象，并由此證明了miR-622 的表達可以參與乳腺癌細胞的生長過程，抑制miR-622 表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲從而參與了抑制乳腺癌細胞轉移的進程。此研究中提示miR-622 在乳腺癌的增殖、遷移和侵襲中起促進作用。魏晰麟等[10]研究發現，在結腸癌中miR-622 表達是升高的，促進miR-622 的表達水平后可下調DYRK2 表達并使得SW1116 細胞侵襲轉移作用增強。李仲均等[11]研究顯示，miR-622 在卵巢上皮性癌組織中表達增高可能發揮促癌作用。說明miR-622 確實可通過影響某些通路而促進癌癥的轉移與發展，產生促癌作用。然而有研究結果顯示miR-622 的表達在膠質母細胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌等癌癥中上調。Wang X 等[8]的研究，在膠質母細胞瘤的進展中，增高的miR-622 抑制K-Ras 的表達從而發揮了遏制癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。通過靶向調節c-Myc，miR-622過度表達抑制膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-622 則產生相反的結果[9]。上述研究中提示上調miR-622 可抑制腫瘤的發生發展過程，而抑制miR-622 可減弱這一作用。Orlandella FM 等[4]及Liu C 等[5]的研究顯示，高表達miR-622 抑制乳腺癌細胞的轉移，本研究結果與上述研究存在差異，可能通過不同的信號通路以及與不同的分子協作或拮抗發揮不同的作用有關。miR-622 家族對促進或抑制腫瘤發生發展的作用方面的研究存在不同意見。

為了進一步研究miR-622 調控乳腺癌細胞的機制，本研究根據生物信息學，尋找到EYA1 基因與miR-622 具有結合位點，用Western blot 檢測了miR-622 inhibitor 轉染后細胞中EYA1 表達水平，試圖尋找EYA1 基因與miR-622 存在關聯的證據。EYA1 即“果蠅眼缺失”基因，是與果蠅眼睛形態發育有關的重要調控因子[12]。在人類身上，EYA 基因家族的缺失或突變，會造成一種常染色體顯性遺傳性疾病，即鰓-耳-腎綜合征，該病以腎臟發育異常或缺失、鰓裂發育異常、耳前瘺管以及聽力損失為特征[13-15]。近年來，有關EYA1 在各種腫瘤惡性進展中的作用機制的研究得到大量關注。然而有關EYA1 在乳腺癌中的作用機制的研究報道較少，本研究在乳腺癌細胞中轉染miR-622 抑制物后發現EYA1 表達增高，說明抑制miR-622 表達可上調EYA1 的水平，結果提示miR-622 可能負調控EYA1 的表達。在本研究中，抑制miR-622 表達可能對癌細胞增殖起削弱作用，同時EYA1 的表達水平升高，實驗提示miR-622 水平降低有可能通過調控EYA1 來實現對乳腺癌細胞增殖的抑制作用。在本研究中，EYA1 可能起抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲的作用，而在某些研究中EYA1 卻扮演著促癌基因的角色。Kong D 等[16]發現在肝細胞癌中，EYA1與侵襲性以及不良預后有明顯的關聯，研究顯示在肝細胞癌中EYA1 的表達提高，并且可使得肝癌細胞的遷移和侵襲作用加強。Cai S 等[17]探究結直腸癌中的發病機理時，發現EYA1 表達水平增高可誘導促進結直腸癌轉移。且Guan H 等[18]的研究探討了EYA1 在乳腺癌中的作用，結果提示靶向下調EYA1 減弱了乳腺癌細胞的增殖作用。在癌癥發生機制中，一般存在多種因素相互作用產生抑癌或促癌效果，EYA1 在乳腺癌中的具體作用仍是需要研究的方向，目前尚無實驗證據證明miR-622 是否與EYA1 存在結合位點，且miR-622 下調EYA1 是否在乳腺癌的發病機制中發揮效果以及可能存在的具體信號通路仍有待進一步探討。

綜上所述，上述研究提示抑制miR-622 的表達后可抑制乳腺癌的增殖、侵襲與遷移，抑制乳腺癌的轉移，miR-622 是腫瘤發生、發展過程中的重要環節，為乳腺癌基因治療提供了新的靶點并且可作為靶向藥物開發的新方向，促進腫瘤精準治療。并且miR-622 可能負調控EYA1 發揮作用，然而miR-622 調控EYA1 的機制以及上下游通路仍有待進一步探索，為以后有關乳腺癌的實驗研究提供了新思路。