高脂飲食誘導非酒精性脂肪肝的發病機制研究

李 春，梅 聰，周 瓊，朱麗芹，王毅鵬，翁曉春，周松蘭，唐 哲

（昆明市延安醫院內分泌科，云南 昆明 650051）

隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）對人類健康的危害也越來越大[1，2]。NAFLD 包括單純性脂肪肝（nonalcoholicsimple fatty liver，NAFL）、脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化、肝硬化，甚至進展為肝細胞癌等一系列相互聯系的病理改變[3]。與單純NAFLD 患者相比，NASH 的存在增加了肝臟疾病的風險，也可能增加心血管疾病和惡性腫瘤等非肝臟相關疾病的風險[4-6]。NAFLD 發病機制復雜，“二次打擊”理論（Two hit theory）其中之一，第一次打擊誘發肝臟脂肪變性，第二次打擊來自氧化應激引起炎癥、纖維化、壞死等[7]。Kupffer 細胞在經典激活（M1）和選擇性激活（M2）兩種狀態之間的轉換可能也在NAFLD 的發生發展過程中發揮重要作用[8，9]。基于此，本研究通過高脂飲食建立NAFLD 的小鼠模型，動態觀察小鼠肝臟的Kupffer細胞在疾病的發展和演變過程中的變化，分析其在炎癥募集和炎癥持續機制中的作用，明確Kupffer 細胞在M1 和M2 之間的轉換與NAFLD 發病機制的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 30 只C57BL/6J 小鼠購自中科院上海實驗動物中心，PBS 溶液：將1 包磷酸緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）粉劑（購自索萊寶）完全溶解于2000 ml 蒸餾水中，混勻后，調整pH 值在7.2～7.4 備用。4%多聚甲醛：將40 g 多聚甲醛（購自Sigma）完全溶解于加熱的1000 ml 蒸餾水中，恢復室溫后備用。甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、胰島素和血糖試劑盒購自Elabscience。IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS，MCP-1、VEGF 和IL-10 的ELISA 試劑盒購自Abcam。

1.2 高脂飲食誘導小鼠NAFLD 模型 30 只C57BL/6J小鼠隨機分為普通飲食組、4 周高脂飲食組（88%普通飲食+10%豬油+2%膽固醇）和8 周高脂飲食組，每組10 只。所有食物均經高溫消毒滅菌后使用。飼養環境條件：溫度20 ℃～22 ℃，濕度50%～55%，明暗各12 h。

1.3 檢測指標

1.3.1 小鼠狀態監測 每周稱重1 次小鼠體重，觀察其食欲行為、精神狀態和毛發情況等。

1.3.2 標本采集 小鼠處死前隔夜禁食，使用異氟烷吸入麻醉。切開腹腔后從下腔靜脈取血，采集的血液標本在4 ℃下1000xg 離心10 min 后，取上層血清，保存在-80 ℃冰箱用于后續檢測。切開右心房，以22G 導管行門靜脈插管，用PBS 以10 ml/min 灌注肝臟5 min 后摘取肝臟。切取2 cm×2 cm 大小肝臟組織，使用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續切成5 μm 組織切片用于HE 染色。肝組織切片經HE染色后，光鏡下評估肝脂肪變性和炎癥活動情況，HE 切片用OLYMPUS 攝像系統進行觀察和攝片。剩余的肝臟組織剪碎，用于Kupffer 細胞的分離和原代培養，加入30 ml 濃度為1 mg/ml 的Ⅳ型膠原酶液37 ℃水浴消化30 min，用100 μm 濾網過濾消化液，留取濾液，4 ℃下300xg 離心5 min，2 次，棄上清，以PBS 重懸沉淀，4 ℃下50xg 離心3 min，上層懸液再以300xg 離心5 min，棄上清，沉淀用高糖DMEM 培養基（含10%胎牛血清，100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素）重懸，在含5%CO2的細胞培養箱中37 ℃下培養2 h，棄去培養液，以PBS 洗滌1 次，再加入新鮮培養液繼續培養。

1.3.3 血清學實驗室指標檢測 參考說明書使用TG、TC、ALT、AST、胰島素（I）、血糖（G）試劑盒分別檢測不同飲食組小鼠血清中各指標的含量。

1.3.4 細胞因子檢測 Kupffer 細胞以PBS 洗滌3次后，用高糖DMEM 培養基（100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）重懸，調整細胞濃度至1×105/ml，接種于96 孔培養板中，每組3 個復孔，于24 h 后收集培養上清，根據說明書應用ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、MCP-1、VEGF 和IL-10指標。

1.4 統計學分析 所有的數據使用Graphpad Prism 7.0 處理。連續型變量以（）表示，分類變量以（%）表示。連續型變量使用非配對t檢驗，分類變量使用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠狀態比較 各組小鼠在實驗終點結束前均無死亡，習性、毛發、活動等均無異常。在高脂飲食初期，各組小鼠進食量無顯著變化，之后4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組的小鼠進食量增加。三組實驗前體重比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；處死時，高脂飲食組的小鼠體重高于對照組，且8 周高脂飲食組體重高于4 周高脂飲食組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠體重變化情況（，g）

表1 各組小鼠體重變化情況（，g）

2.2 三組血清學指標比較 4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組胰島素、血糖、TG、TC、AST 和ALT 水平均高于普通飲食組，且8 周高脂飲食組高于4 周高脂飲食組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖1。

圖1 三組血清學指標比較圖

表2 三組血清學水平比較（n=10，）

表2 三組血清學水平比較（n=10，）

2.3 三組組織學觀察 普通飲食組小鼠肝臟外觀表現尺寸正常，密度正常，有光澤，質軟，色澤深紅色，邊緣銳利。肝組織切片HE 染色后可見肝細胞大小正常，呈竇索狀分布，細胞內未見脂肪浸潤，無小葉和匯管區炎性細胞浸潤，無纖維組織形成，見圖2A。4 周高脂飲食組肝臟明顯腫脹增大，色澤土黃，邊緣鈍，標本密度降低（漂浮于中性甲醛液面上）。組織切片可見脂滴彌漫浸潤肝細胞中，脂肪變性的肝細胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加；8 周高脂飲食組的肝臟外觀與4 周高脂飲食組相似，標本密度降低更明顯；組織切片可見脂滴彌漫浸潤肝細胞中，脂肪變性的肝細胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加，胞漿的脂肪空泡較4 周高脂飲食組增多，呈大泡型。

圖2 三組肝臟組織觀察（HE 染色，×40）

2.4 三組細胞因子水平表征 4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組TNF-α、IL-6、MCP1、IL-1β、iNOS 及VEGF 水平均高于普通飲食組，且8 周高脂飲食組高于4 周高脂飲食組，差異有統計學意義（P＜0.05）；4 周高脂飲食組和8 周高脂飲食組IL-10 水平低于普通飲食組，且8 周高脂飲食組低于4 周高脂飲食組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 三組促炎和抗炎細胞因子比較圖

表3 三組炎癥因子水平比較（n=10，）

表3 三組炎癥因子水平比較（n=10，）

3 討論

NAFLD 是最常見的慢性肝病。2 型糖尿病是NAFLD 的重要危險因素。NAFLD 患者通常表現為胰島素抵抗，并且血糖上升或合并糖尿病的患者的死亡率顯著上升[10]。此外，T2DM 似乎加速了NAFLD肝臟疾病的進展，必須優先提高對2 型糖尿病患者非酒精性脂肪肝重要性的認識[11，12]。本研究通過高脂飲食飼養小鼠建立NAFLD 動物模型，結果顯示4周高脂飲食組和8 周高脂飲食組胰島素、血糖、TG、TC、AST 和ALT 水平均高于普通飲食組，且8 周高脂飲食組高于4 周高脂飲食組，差異有統計學意義（P＜0.05）。除了TG 和TC 升高外，小鼠胰島素水平和血糖水平也顯著升高，提示NAFLD 合并糖尿病的風險。另外，AST 和ALT 的升高也反應當前肝臟組織的炎癥損傷狀態。

除了血液檢測指標之外，肝臟組織切片染色可直接顯示NAFLD 的病理過程變化，并且在疾病的診斷中發揮重要作用。既往有學者報道了一種基于脂肪變性程度的NAFLD 組織病理學損害分級和分期系統[13]。本研究中肝臟組織HE 染色顯示臟明顯腫脹增大，可見脂滴彌漫浸潤肝細胞中，脂肪變性的肝細胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加。高脂飲食組肝臟組織分離和原代培養的Kupffer 細胞（肝巨噬細胞）分泌大量促炎癥細胞因子，包括TNF-α、IL-6、MCP1、IL-1β、iNOS 和VEGF，此外抗炎細胞因子IL-10水平分泌顯著降低。表明NAFLD 小鼠模型的血糖和胰島素水平均升高，這與臨床中NAFLD 患者死亡的高危因素包括糖尿病密切相關[14]。而小鼠肝臟組織切片表現出的肝臟明顯腫脹增大，色澤土黃，邊緣鈍，標本密度降低，脂滴彌漫浸潤肝細胞中，脂肪變性的肝細胞極度腫脹呈圓形，體積較正常明顯增加，這些特征均是NAFLD 的典型病理特征。分析原因為Kupffer 細胞能通過M1 和M2 通路進行轉換和調節。已有研究表明[15-17]，破壞Kupffer 細胞可以減輕肝臟的組織學表現，如脂肪變性、炎癥、壞死等。M1/M2 型Kupffer 細胞比例失調會引起NAFLD 向肝細胞癌的轉變，其比例顯著降低，提示增加M1 型Kupffer 細胞的數量可能是潛在的逆轉NAFLD 發展為肝癌的重要手段[18]。另有研究則顯示脂質可誘導Kupffer 細胞分化，并且不同類型的脂質誘導分化的能力不同，本研究同樣使用高脂飲食來使Kupffer 細胞釋放更多促炎癥細胞因子，抑制抗炎細胞因子釋放，其結果一致[19]。長期運動可恢復NAFLD 肥胖小鼠Kupffer 細胞受損的吞噬能力，可能是通過增加脫氫表雄酮（DHEA）產生，改善肝臟炎癥和纖維化防止NASH 發生[20]，提示肝臟Kupffer 細胞功能的異常在NAFLD進展中的重要作用。

綜上所述，本研究通過血液指標和組織切片圖像證實了脂肪肝形成的病理生理學特征以及炎癥細胞的浸潤，Kupffer 細胞促炎細胞因子分泌增加而抗炎細胞因子水平下降使肝臟組織處于高炎癥狀態，向M1 型巨噬細胞分化造成組織炎癥損傷是NAFLD 進展的關鍵因素。