STAT3、NCK1 和VEGF 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義

李佳楠，陳春悠

（1.華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000；2.唐山市工人醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 063000）

對于手術(shù)難以根除的難治型甲狀腺癌，積極尋找特異性高、靈敏度強的分子標(biāo)記物是十分必要的。STAT3 屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activators of transcription，STATs）家族成員，作為原癌基因可以加速癌細(xì)胞增殖，延緩癌細(xì)胞凋亡，幫助癌細(xì)胞逃脫免疫識別，誘導(dǎo)腫瘤血管生成并參與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。非催化區(qū)域酪氨酸激酶1（non-catalytic region of the tyrosine kinase adaptor protein 1，NCK1）是一種信號內(nèi)接頭蛋白，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)，并與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）不僅參與腫瘤微血管的生成過程，還參與惡性腫瘤淋巴管生成等過程。本研究主要STAT3、NCK1、VEGF 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)水平、相關(guān)性以及與甲狀腺臨床病理特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集2019 年9 月-2020 年12 月唐山市工人醫(yī)院頭頸外科病理診斷明確的甲狀腺乳頭狀癌組織63 例、甲狀腺腺瘤組織32 例、正常甲狀腺組織（選取距離腫瘤病灶大于2 cm，經(jīng)病理證實無異常的甲狀腺組織）20 例。所有病例臨床資料完整，病理診斷明確，且取材前無其他頭頸部腫瘤史及放化療史，均為第1 次接受甲狀腺外科手術(shù)。

1.1.2 實驗試劑 兔抗人STAT3 多克隆抗體、兔抗人NCK1 多克隆抗體、兔抗人VEGF 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB 試劑盒、PV6000 通用型試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法 采用免疫組化SP 法染色，具體實驗操作步驟按試劑說明書操作。陽性對照以試劑公司提供的陽性切片作為標(biāo)準(zhǔn)，陰性對照以PBS 液代替一抗作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 結(jié)果判讀 STAT3、NCK1 的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其次為細(xì)胞核；VEGF 的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為彌散的顆粒狀染色。采用雙盲法由2 名病理科醫(yī)生在400 倍高倍鏡下隨機選取5 個不少于100個細(xì)胞的視野，取其平均值。評判標(biāo)準(zhǔn)[1]：陰性（-）：基本無著色；弱陽性（+）：≤10%的細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的細(xì)胞質(zhì)著色；陽性（++）：10%～30%的細(xì)胞呈現(xiàn)強的棕褐著色的細(xì)胞質(zhì)著色，或≤70%的細(xì)胞呈現(xiàn)弱或中等強度的細(xì)胞質(zhì)著色；強陽性（+++）：＞30%的細(xì)胞呈現(xiàn)強的棕褐著色的細(xì)胞質(zhì)著色或＞70%的中等強度細(xì)胞質(zhì)著色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；采用Spearman秩相關(guān)性分析甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達(dá)的關(guān)系。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達(dá)情況比較 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 陽性表達(dá)率高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織中STAT3、NCK1、VEGF 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同甲狀腺組織中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達(dá)情況比較[n（%）]

2.2 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白與臨床病理的關(guān)系 STAT3 陽性表達(dá)與腫瘤直徑、是否伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、病灶數(shù)、是否侵犯甲狀腺外被膜、是否合并橋本甲狀腺炎無關(guān)（P＞0.05）；NCK1 陽性表達(dá)與是否伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑、病灶數(shù)、是否侵犯甲狀腺外被膜、是否合并橋本甲狀腺炎無關(guān)（P＞0.05）；VEGF 陽性表達(dá)與腫瘤直徑、是否侵犯甲狀腺外被膜和是否伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、病灶數(shù)、是否合并橋本甲狀腺炎無關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白與臨床病理的關(guān)系[n（%）]

表2（續(xù)）

2.3 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3 與NCK1 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.483，P＜0.05）；STAT3 與VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.584，P＜0.05）；NCK1 與VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.477，P＜0.05）。

3 討論

惡性腫瘤的生長發(fā)育過程中往往由于空間有限而伴隨著缺氧、高壓、高滲等環(huán)境，在這種惡劣環(huán)境中，腫瘤微血管生成和抑制的平衡關(guān)系被打破，癌細(xì)胞內(nèi)各種調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長的基因開始表達(dá)并參與到腫瘤微血管生成的過程中，為腫瘤提供血液和氧氣，使得腫瘤體積不斷增大。同時，腫瘤微血管生成也是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移行為的基礎(chǔ)[2，3]。腫瘤微血管的形成與惡性腫瘤的不良生物學(xué)行為和預(yù)后直接相關(guān)，因此研究腫瘤微血管生成的相關(guān)調(diào)節(jié)因子，以及其可能存在的作用機制對于患者預(yù)后的評估和未來腫瘤治療靶點的探索有著積極意義。

VEGF 在腫瘤血管生成的過程中扮演著不可或缺的角色。頭頸部腫瘤，如下咽癌[4]、口腔癌[5]、甲狀腺癌[6]，因其生長空間有限，使得局部缺氧環(huán)境更加容易形成，最終造成腫瘤微血管的形成。在目前已知的腫瘤微血管形成的過程中，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞通過自分泌和旁分泌VEGF，進(jìn)而參與誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)部形成新生微血管，并造成血管內(nèi)皮生長和抑制的失衡。此外，新生微血管的形成造成腫瘤內(nèi)部微環(huán)境改變，形成缺氧環(huán)境，缺氧誘導(dǎo)因子活化后使得VEGF 的轉(zhuǎn)錄程度進(jìn)一步增強，加劇了腫瘤微血管的生成，從而使得腫瘤不斷獲取養(yǎng)分而生長發(fā)育[7]。VEGF 不僅參與調(diào)控腫瘤微血管的生成過程，還參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。同時，VEGF 可以協(xié)同VEGF-C通過直接和間接的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過微淋巴管轉(zhuǎn)移至全身。另外，VEGF 通過增加淋巴管上皮的通透性和改變細(xì)胞粘附性等手段促進(jìn)惡性腫瘤通過淋巴管轉(zhuǎn)移，參與其轉(zhuǎn)移過程[8，9]。NCK1 定位于人的染色體3q22.3，位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化蛋白。NCK1 具有Src 同源性2 和3 結(jié)構(gòu)域，即SH2和SH3 結(jié)構(gòu)域，而SH2 和SH3 結(jié)構(gòu)域也賦予了NCK1 參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞分裂增殖和遷移過程的能力[10-12]。Morris DC 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NCK1 作為原癌基因可以促進(jìn)乳腺癌的侵襲和肺轉(zhuǎn)移等過程，當(dāng)NCK1 被抑制表達(dá)時，乳腺癌細(xì)胞的侵襲性降低。Xia P 等[14]通過免疫組化、Western blot、ELISA 檢測等手段證實了NCK1 參與調(diào)節(jié)宮頸鱗癌微血管生成的過程，其通過上調(diào)VEGF 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)宮頸癌腫瘤微血管的形成，使腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移行為獲得養(yǎng)分支持。STATs 家族存在于細(xì)胞漿中，是一類具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的蛋白家族。STAT3 作為原癌基因，在正常組織中的激活受到嚴(yán)格把控，而在惡性腫瘤中，STAT3 持續(xù)的激活可以誘導(dǎo)Bcl-2、c-Myc 和Bcl-XL 過度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖，也可以參與腫瘤細(xì)胞逃避免疫識別、促進(jìn)血管生成過程中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄[15，16]。伍婧等[17]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中STAT3 與VEGF 的表達(dá)明顯升高，且與結(jié)腸癌的血管生成密切相關(guān)。

本研究通過免疫組化法檢測并比較了STAT3、NCK1、VEGF 在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 陽性表達(dá)率高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示三者可以作為鑒別不典型甲狀腺良惡性腫瘤的指標(biāo)。通過對甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白與臨床病理的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌中腫瘤直徑越大，STAT3 和VEGF 的表達(dá)越顯著，說明二者參與了甲狀腺乳頭狀癌的生長發(fā)育過程中，并在其過程中起到了促進(jìn)作用。而VEGF 的表達(dá)情況還與癌灶是否侵犯甲狀腺外被膜相關(guān)，表明VEGF 與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲性密切相關(guān)，隨著甲狀腺癌的不斷進(jìn)展，VEGF 的表達(dá)水平不斷升高，最終導(dǎo)致癌灶向外侵襲，并突破被膜侵犯周圍肌肉和神經(jīng)組織。此外，STAT3、NCK1、VEGF 均與甲狀腺乳頭狀癌患者的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示三者均參與了甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程，檢測三者的表達(dá)水平對鑒別患者是否發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有重要意義。甲狀腺癌多來源于甲狀腺濾泡上皮惡變，在惡變的過程中伴隨著血管生成和抑制功能的失調(diào)，其中異常表達(dá)的VEGF 在誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成的過程中起到了關(guān)鍵作用[18，19]。Zhang F 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中NCK1 是STAT3 的一個下游信號分子，在STAT3 的調(diào)控下，NCK1 高表達(dá)并且參與促進(jìn)了結(jié)直腸癌血管生成過程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌中STAT3 與NCK1 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.483，P＜0.05）；STAT3 與VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.584，P＜0.05）；NCK1 與VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.477，P＜0.05），提示在甲狀腺癌進(jìn)展過程中STAT3、NCK1、VEGF 的表達(dá)同樣存在較強的相關(guān)性，由此可以推斷，STAT3 和NCK1 作為癌基因相互作用，可以誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)，促使腫瘤微血管形成；同時三者還可通過協(xié)同作用，以直接或間接的方式促使甲狀腺乳頭狀癌通過淋巴管向頸部轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者不良預(yù)后。

綜上所述，STAT3、NCK1 與VEGF 三者在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)水平高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織，可為臨床鑒別不典型甲狀腺良惡性腫瘤提供思路。此外，STAT3 和NCK1 不僅能誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，三者還可協(xié)同參與甲狀腺乳頭狀癌的生長發(fā)育，侵犯甲狀腺外被膜和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。