脾臟硬度聯合流式細胞術在急性髓系白血病微小殘留病監測中的意義

趙崇山，王寧方

（河北中石油中心醫院感染科1，血液科2，河北 廊坊 065000）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是起源于造血干/祖細胞的克隆性惡性血液病，隨著新藥的使用及造血干細胞移植的開展，有70%～80%AML 患者可以獲得完全緩解，但仍有50%～70%患者最終復發[1-4]。微量殘留病（minimal residual disease，MRD）指白血病患者按療效標準經過治療取得完全緩解（complete remission，CR）后體內殘存微量白血病細胞的狀態。據研究表明[5]，若MRD 水平在治療后第12 周仍高于10-4時，則急性白血病復發的概率極高。因此，通過監測MRD 水平可預測早期復發。但目前對于無特異融合基因及重現性遺傳學異常的AML 患者，緩解后MRD 的監測缺乏有效的手段。近年來，FibroScan（FS）檢測脾臟硬度（SSM）已被廣泛應用于門脈壓力與食管靜脈曲張出血的評估[6，7]。有研究報道[8]，FS 或可用來評估骨髓纖維化患者抗JAK2 治療的效果。而白血病患者常伴有脾臟增大，且脾臟硬度增加往往比脾臟體積增大出現更早。因此，進行SSM 動態監測或可預測MRD 的變化，進而可以對白血病化療后復發進行監測。為此，本研究選擇33 例初診AML 患者展開研究，分析SSM 與MRD 的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年3 月-2020 年3 月于河北中石油中心醫院就診的初治AML 患者（非M3）33 例，男17 例，女16 例；年齡24～82 歲，中位年齡53 歲；其中M0 3 例，M1 5 例，M2 10 例，M4 7 例，M5 8 例；隨訪時間為3～36 個月，中位隨訪時間18個月。納入標準：根據患者骨髓細胞學、免疫分型、細胞遺傳學、分子生物學、骨髓病理等確診為AML。排除標準：①不能控制的癲癇患者；②有嚴重未控制的精神疾病。復發標準：完全緩解后外周血重新出現白血病細胞或骨髓原始細胞＞0.05 或髓外出現白血病細胞浸潤。流式檢測骨髓中白血病細胞≥0.01%和＜5%為MRD 陽性，白血病細胞＜0.01%為陰性。將33 例初治AML 患者作為初診組，經誘導化療后作為誘導化療后組，根據MRD 變化情況將誘導化療后患者進一步分為MRD+組、MRD-組；另收集15例健康志愿者作為對照組，對照組中男8 例，女7例；年齡34～60 歲，中位年齡52 歲。

1.2 方法 收集患者臨床資料，通過門診及電話對患者預后情況進行隨診。SSM 檢測：采用FibroScan 502（購自法國Echo Sens 公司）通過瞬時彈性成像技術檢測SSM。檢測時間點：AML 患者初診、誘導化療后14 d、隨后每2 個月1 次。由同1 名專業醫師對患者及健康志愿進行檢測，測量區域要求遠離脾臟邊緣，沒有大血管結構，脾臟有足夠的厚度，將掃描儀M 探頭垂直于受檢者的皮膚表面，患者取側臥位，左上肢上舉，將探頭置于其左腋前線9～11肋間[9]，檢測成功需滿足以下條件：檢測成功10 次以上，四分位間距≤30%，成功率≥60%[10]，檢測值以Kpa 表示。無血栓生存期（Thrombosis-free survival，TFS）定義為確診時間至治療期間發生血栓或隨訪結束，隨訪時間7～56 個月，中位隨訪時間33 個月。MRD 檢測：AML 患者初診、誘導化療后14 d、隨后每2 個月1 次抽取肝素抗凝骨髓血3 ml，對細胞進行計數，調整每管細胞106個，加入抗CD56-FITC、CD15 -FITC、CD64 -FITC、CD19 -PE、CD11b -PE、CD34 -PE、CD117 -PE、CD45 -Percp、CD33 -APC、CD13-APC、CD14-APC、HLA-DR-APC 單抗（beckman coulter，BD）各20 μl，混勻，室溫避光孵育20 min，后加入紅細胞裂解液裂解紅細胞15 min，離心去上清，用PBS 洗滌兩遍，條件500 g×5 min，最后用PBS重懸細胞，用用流式細胞儀（BD 公司的FACS CaliburTM）進行檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 軟件包進行數據的統計學分析。計量資料用（）表示，正態分布采用t檢驗或單因素方差分析，非正態分布用Kruskal Wallis 或Mann-UhitneyU檢驗，組間比較用Bonferroni 法，相關性采用Spearman 相關分析。所有檢驗均為雙側檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組間SSM 比較 對照組、初診組、誘導化療后組SSM 值比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中初診組SSM 高于對照組、誘導化療后組，見表1。誘導化療后患者中，MRD+組SSM 高于MRD-組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2；Spearman 相關性分析顯示，MRD+組SSM 與MRD 水平呈正相關（r=0.877，P=0.000）。

表1 對照組、初診組、誘導化療后組SSM 比較（，Kpa）

表1 對照組、初診組、誘導化療后組SSM 比較（，Kpa）

表2 誘導化療后不同MRD 組間SSM 比較（，Kpa）

表2 誘導化療后不同MRD 組間SSM 比較（，Kpa）

2.2 復發及持續緩解患者SSM 的動態隨訪 治療后復發及持續緩解患者SSM 變化見圖1。8 例患者復發時間均在1 年內，其中患者2 在1 年內有2 次復發，隨訪時間分別為2、12 個月；7 例患者復發時SSM 升高，有明顯的峰值，這些患者復發時均采取再誘導化療，化療后SSM 仍可下降；患者6 在隨訪過程中SSM 未升高，最終在隨訪12 個月時復發（圖1B）。9 例持續緩解患者SSM 波動在3.9～8.7 Kpa，總體呈下降趨勢，無明顯峰值（圖1A）。SSM 在復發時升高，治療后不同程度下降。

圖1 AML 患者SSM 的動態隨訪

3 討論

AML 是發生于造血干/祖細胞的惡性增殖性疾病。MRD 是影響AML 患者生存的重要因素，是復發的根源[11，12]。檢測化療后MRD 對AML 患者的危險分層以及治療方案的選擇具有重要作用。FS 因其具有無創、快速、準確度高等特點在肝病方面有廣泛應用[13]。目前，SSM 可用來預測膽道閉鎖患兒的食管胃底靜脈曲張程度[7，14]。而急性髓性白血病常伴有脾臟增大，因此本研究應用FS 對AML 患者進行SSM 檢測，結果發現發現AML 患者治療前SSM 高于對照組，猜測SSM 可能與AML 的發生發展有關。本研究還顯示，誘導化療后組SSM 較初診組降低，提示在誘導化療后隨著疾病的緩解，患者SSM 也同步下降，進一步證實了SSM 變化與AML 發生發展有關，而較低的SSM 值往往預示著較高的緩解程度，而較高的SSM 值則提示較差的緩解狀態或高復發風險。

研究報道[15]，AML 患者完全緩解后MRD 水平在＜10-4、10-4～10-3、10-3～10-2、＞10-2的患者3 年復發率分別為0、14%、45%、85%。另有研究發現[16]，誘導治療后及鞏固治療后MRD 水平與AML 患者的臨床結局有關，且鞏固治療后MRD 水平是影響預后的獨立因素。本研究發現，誘導化療后MRD+組SSM高于MRD-組，且誘導化療后MRD+組SSM 與MRD水平呈正相關。由此推測，誘導化療后SSM 值越高，MRD 水平越高，復發率可能越高，患者預后更差。需要說明的是，臨床上監測MRD 需要進行多次骨髓穿刺，而SSM 檢測為無創檢測，在不增加患者痛苦的情況下可以更好的監測AML 的復發情況。

融合基因定量檢測可作為預測AML 患者血液學復發的可靠指標，但基因檢測花費大，耗時多，對實驗室要求較高，常規開展存在一定難度。本研究發現，8 例復發患者均在1 年內，可能與患者年齡偏大及采取的治療方案有關。7 例患者復發時SSM 升高，有明顯的峰值，而再誘導化療后SSM 有不同程度下降。患者6 在隨訪過程中SSM 未升高，最終在隨訪12 個月時復發，復發時間較其他患者晚。9 例持續緩解患者SSM 值較低，總體呈下降趨勢。因此，誘導化療后SSM 再次升高者提示存在復發風險，而持續低SSM 可能預示患者處于緩解狀態。誘導化療后SSM 高者采取異基因造血干細胞移植或可提高患者的生存期，而SSM 低者或可適當降低化療強度，以避免過強化療所致的臟器損害。

綜上所述，誘導化療后SSM 與MRD 密切相關，檢測SSM 或可聯合FCM 檢測對AML 患者進行動態隨訪，以進一步評估其預后，指導臨床治療。