智三針對血管性癡呆小鼠前額葉和海馬小清蛋白、生長激素抑制素、神經肽Y神經元表達的影響

楊培丹，賀君，譚穗

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指各類腦血管疾病（如出血性或缺血性腦卒中）引起的腦功能障礙而產生的階梯性神經退行性疾病[1-2]，患病率約占癡呆患者總數的30.6%[3]。與阿爾茨海默癥（Alzheimei’s disease，AD）的區別點在于，VD是可防治的一種可逆性神經退行性疾病[4]。VD的發生、發展涉及復雜的病理、生理過程，與神經遞質系統紊亂[5]、氧化應激反應[6]、神經炎癥[7]和Ca2+代謝異常[8]密切相關。然而，目前尚未有明確批準用于治療VD的特效藥物和干預措施。前期研究顯示，與西藥對照組相比，以智三針為主的針刺治療組能夠改善VD患者的學習認知記憶能力及生活自理能力[9]，具有安全性高、毒副作用小的優點，但其機理目前尚未完全闡釋。研究表明，前額葉、海馬結構參與學習、工作記憶等高級認知功能的發生及發展過程，兩者間存在神經纖維投射[10]。抑制性神經遞質γ-氨基丁酸（GABA）中間神經元表達量的下降，如相關的亞型神經元小清蛋白（PV）、生長激素抑制素（SST）和神經肽Y（NPY）與認知記憶功能障礙密切相關[11]。因此，腦組織缺血缺氧條件下，海馬-前額葉的神經環路、腦內GABA神經遞質紊亂，可能與VD的出現有關。本研究通過構建VD小鼠模型，觀察電針智三針對VD小鼠的行為學改變及GABA亞型PV、NPY和SST神經元表達的影響，探討智三針治療VD的可能機理，為臨床應用智三針治療VD提供實驗依據。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SPF級雄性C57BL6J小鼠，8～10周齡，體質量（25±3）g。由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（粵）2018-0034]，在廣州中醫藥大學華南針灸研究中心適應性喂養1周后進行實驗。實驗操作及實驗流程嚴格按照頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[12]。

1.2 主要儀器與設備新物體實驗箱及Digbehv動物行為視頻分析軟件（上海吉量軟件科技有限公司提供）；Y迷宮實驗箱及Digbehv動物行為視頻分析軟件（上海吉量軟件科技有限公司提供）；華佗牌一次性無菌針灸針（規格0.25 mm×13 mm，蘇州醫療用品廠有限公司提供）；電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司提供）；動脈止血夾（深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司提供）；冰凍切片機（Thermo公司提供）。

1.3 主要試劑異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供）；抗PV抗體、抗SST抗體、抗NPY抗體、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?488，Abcam上海貿易有限公司）。

1.4 分組與造模從40只雄性C57BL6J小鼠中隨機選取32只進行造模，其余8只設為假手術組。按照此前文獻的VD小鼠模型造模方案[13]，以可逆性夾閉雙側頸總動脈法建立VD小鼠模型。造模方法如下：經異氟烷氣麻后，將小鼠的四肢固定在泡沫塑料板上，頸部進行消毒，用彎剪除去頸部毛發，以鑷子鈍性分離頸部動脈和迷走神經后，用動脈夾反復夾閉雙側頸總動脈20 min，再通10 min，重復3次。假手術組小鼠僅用無菌鑷分離兩邊的頸總動脈和迷走神經。手術后將小鼠放入保暖箱中，等待蘇醒，注意查看生命體征。術后14 d，使用Y迷宮和新物體實驗進行模型檢驗，若行為學數據低于2倍標準差[14]，表明造模組小鼠存在空間工作記憶障礙。將造模成功的小鼠隨機分為智三針組、模型組和非穴組，每組各10只。

1.5 干預方法選擇在造模成功的次日進行干預治療。（1）智三針組：參照《實驗針灸學》動物穴位定位標準[15]，以“神庭”（即百會穴正中前下方約2 mm處）、“本神”（即神庭穴兩側旁開0.5 mm，共2穴）作為針刺點。針刺深度在2～3 mm，平刺，雙側本神接入電針儀正負極，設定為疏密波（頻率為20 Hz），留針20 min，每日1次，干預28 d。（2）非穴組：參考文獻的定位方法[16]，選取兩側肋弓旁、距髂嵴10 mm為針刺部位，針刺深度在2～3 mm，斜刺，針刺后接入電針儀，疏密波（頻率為20 Hz），留針20 min。（3）模型組和假手術組：無需電針干預，抓取、固定，置氣麻箱中20 min，每日1次，干預28 d。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 行為學觀察

（1）新物體識別實驗：正式實驗前24 h，將小鼠在行為學箱中適應5 min，無需置放任何物體。正式實驗第1天，在行為學箱中放置形狀和大小相同的物體，記錄小鼠10 min探索物體的時間。正式實驗第2天，替換為一個形狀和顏色不同的物體，記錄小鼠5 min內探索新物體和舊物體的時間。每次實驗結束后用75%酒精清潔物體和行為學箱。辨別指數=（探索新物體的時間-探索舊物體的時間）/兩物體總探索時間。

（2）Y迷宮實驗：正式實驗前將小鼠搬運到行為學房間中熟悉環境1～2 h。正式實驗開始后，在一個三邊等長臂組成的Y迷宮行為裝置中，隨機選取其中一個臂，小鼠被任意背對放置在其中一臂的末端，記錄小鼠8 min自由進入各臂的順序（即自發交替行為，計算自發交替率）和總進臂次數。

1.6.2 免疫熒光染色法觀察各組小鼠前額葉和海馬CA1區的PV、NPY、SST神經元表達情況行為學實驗結束后對小鼠進行灌流、取材、固定后進行冰凍切片。從每組中隨機挑選4只小鼠的前額葉皮層和海馬CA1區的腦片，用1×PBS清洗3次，用0.3%TritonX-100加入5%山羊血清進行通透和封閉1 h。隨后，分別加入PV抗體（1∶1 000稀釋）、NPY抗體（1∶200稀釋）和SST抗體（1∶200稀釋），放置于4℃冰箱中，搖床孵育過夜。第2天，回收一抗后，加入山羊抗兔IgG（1∶1 000稀釋），室溫下搖床上孵育60 min，加入DAPI（1∶1 000稀釋）進行染核，8 min后進行清洗、封片。第2天，激光共聚焦顯微鏡進行拍攝，計算各組PV、SST、NPY神經元平均值。

1.7 統計方法采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。根據正態性檢驗結果，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組資料組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗。為進一步了解組間有無顯著性差異，采用LSD法檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。以ImageJ 8.0軟件用于神經元計數。

2 結果

2.1 各組小鼠行為學實驗結果比較新物體實驗結果：與假手術組比較，模型組的新物體辨別系數減少，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，智三針組新物體辨別系數顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。Y迷宮實驗結果：與假手術組比較，模型組的自發交替率下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，智三針組的自發交替率增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，智三針組的總進臂次數增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。行為學實驗結果見表1。

表1 各組小鼠治療后認知行為學變化比較Table 1 Comparison of cognitive behavioral changes in mice of various groups after treatment （±s）

表1 各組小鼠治療后認知行為學變化比較Table 1 Comparison of cognitive behavioral changes in mice of various groups after treatment （±s）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別智三針組非穴組模型組假手術組總進臂次數/次59.83±19.60 55.62±10.78 52.67±11.45 50.50±9.90鼠數/只10 10 10 8舊物體辨別系數0.37±0.16 0.34±0.27 0.28±0.24 0.36±0.18新物體辨別系數0.41±0.14②0.35±0.33 0.27±0.16 0.49±0.37自發交替率/%60.04±8.97②55.46±10.16 50.18±9.69①64.79±10.12

2.2 各組小鼠前額葉皮層PV、NPY、SST神經元數量變化比較治療后，與假手術組比較，模型組的前額葉皮層的PV、NPY、SST神經元表達量顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，智三針組的前額葉皮層的PV、NPY神經元表達量增加（P＜0.05）。與模型組比較，智三針組前額葉皮層的SST神經元表達量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠前額葉皮層中PV、SST和NPY神經元數量比較Table 2 Comparison of the quantity of PV，SST and NPY neurons in mouse prefrontal cortex in various groups （±s，個）

表2 各組小鼠前額葉皮層中PV、SST和NPY神經元數量比較Table 2 Comparison of the quantity of PV，SST and NPY neurons in mouse prefrontal cortex in various groups （±s，個）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

NPY 42.10±5.56②37.17±6.74 24.42±7.12①72.52±6.23組別智三針組非穴組模型組假手術組鼠數/只8 8 8 8 PV 164.17±33.47②114.43±39.08 90.56±46.25①190.26±27.36 SST 80.50±11.27 85.67±18.90 71.67±6.89①121.67±16.80

2.3 各組小鼠海馬CA1區PV、NPY、SST神經元數量變化比較治療后，與假手術組比較，模型組海馬CA1區PV、NPY、SST神經元表達量顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，智三針組的海馬CA1區PV、NPY神經元表達量顯著上升（P＜0.05）。與模型組比較，智三針組海馬CA1區SST神經元表達量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表3和圖1。

圖1 各組小鼠前額葉、海馬CA1區PV、NPY、SST神經元數量比較（×20）Figure 1 Comparison of the expression of PV，NPY and SST neurons in the prefrontal lobe and hippocampus CA1 area in mice of various groups（×20）

表3 各組小鼠海馬CA1區中PV、SST和NPY神經元數量比較Table 3 Comparison of the quantity of PV，NPY and SST neurons in the prefrontal and hippocampal CA1 regions in mice of various groups （±s，個）

表3 各組小鼠海馬CA1區中PV、SST和NPY神經元數量比較Table 3 Comparison of the quantity of PV，NPY and SST neurons in the prefrontal and hippocampal CA1 regions in mice of various groups （±s，個）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

NPY 29.53±10.13②21.07±8.76 15.23±12.05①39.42±6.38組別智三針組非穴組模型組假手術組鼠數/只8 888 PV 49.26±10.17②45.42±11.09 25.18±10.75①77.06±12.24 SST 28.16±10.14 30.51±6.45 27.75±4.37①54.42±10.74

3 討論

有效建立穩定的、可復制的血管性癡呆（VD）動物實驗模型是研究VD病理、生理機制的重要前提之一。關于VD模型的制備方法，包括有雙血管阻斷法、四血管阻斷法、永久性雙側頸總動脈阻斷法、血管內栓塞法等[17]。本次實驗采取雙血管可逆性阻斷法，該手術可復制性高，造模失敗率較低，模型穩定性較好[18]。通過反復夾閉雙側頸總動脈，腦組織反復缺血再灌注損傷，引起大腦前額葉和海馬CA1區的結構損傷和功能改變，最終導致認知損傷和VD的發生。由于C57BL6J小鼠后交通動脈不發達的特性[19]，對腦缺血缺氧極度敏感，最終，我們選擇了雄性C57BL6J小鼠，采用雙血管可逆性阻斷法進行VD造模。

“靳三針”療法[20]是由我國著名針灸名醫靳瑞教授結合多年的臨床實驗和經驗，以及借鑒歷代針灸專家和學者的經驗和研究成果，開發出來的一門獨特的針灸學派。其中，智三針是靳三針療法中與腦血管疾病緊密相關的一組穴組，包括神庭穴和兩側本神穴，主要位于前額，被認為可以治療與精神和認知功能障礙相關的疾病[21]。依據穴位的近治效應，智三針穴組處于大腦額葉頭皮層，與前額葉相對應，對涉及認知、情緒、精神、思維等方面進行調節[22]。此外，神庭穴是督脈上的穴位，與足太陽膀胱經相會，且皆入絡于腦；本神穴是在足少陽膽經上的穴位，與陽維脈相交會，兩者合同，既可調督脈與膽經經氣，又可調神、益智。由此看出，智三針療法在治療如血管性癡呆等智力減退疾病方面，具有獨特優勢。

目前，對于智三針改善VD認知障礙的作用機理尚未完全清楚，相關研究表明，神經遞質系統障礙可能在VD的發生、發展過程中起到關鍵性的作用[23]。VD可能損傷一些與認知相關的大腦皮質區域（海馬、額葉、杏仁核），導致神經遞質如乙酰膽堿、GABA的紊亂[24]。既往研究表明，VD和AD模型鼠出現認知功能的減退可能與海馬GABA神經元的減少緊密相關[25]。PV、NPY和SST是GABA神經元中重要的3個亞型，能調節和促進海馬神經元網絡興奮性，改善認知功能障礙。在有認知功能缺陷的VD或AD模型中，觀察到PV神經細胞的數量顯著下降，推測PV的神經元與空間學習中認知相關，PV可能通過調節γ振蕩節律來改善認知功能障礙[11]。NPY神經元可以調節認知、食物攝入、晝夜節律等人體相關的生物功能，可以起到神經保護的作用[26]。有學者發現，注射一定劑量的SST可以提高VD模型鼠的學習記憶能力，改善模型鼠認知記憶障礙[27]。本研究結果顯示，與模型組比較，智三針組的前額葉區和海馬CA1區PV和NPY神經元表達量顯著增加。提示電針智三針可以上調前額葉和海馬CA1區PV、NPY神經元的表達量，改善小鼠的認知記憶能力。

綜上所述，電針智三針可以提高VD小鼠腦組織前額葉和海馬CA1區的PV和NPY神經元的表達，改善VD小鼠的行為學，發揮保護神經元的作用。本研究從分子生物學層面證實了智三針對VD認知障礙的改善作用，其作用機制可能與上調小鼠前額葉和海馬CA1區的PV和NPY神經元表達，促進神經元再生有關。