糖眼寧調控Nod樣受體蛋白3炎癥小體通路對糖尿病大鼠視網膜細胞焦亡的影響

崔家霖，邢俊艷，王鶯潔，高彥彬

（1.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069；2.中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，是糖尿病導致的視網膜微血管滲漏和阻塞，從而引起視力受損的眼底病變。臨床所見，單純的控制血糖尚不能有效地阻止糖尿病患者視力的進行性衰減[1]。糖眼寧（舊稱糖網明合劑）是首都醫科大學附屬中醫醫院協定處方，前期臨床研究發現，糖眼寧可以減少患者視網膜毛細血管微血管滲出，明顯縮短患者視網膜平均循環時間，縮小視網膜毛細血管無灌注區[2-4]。據此，本課題組認為糖眼寧可以改善眼底血液循環，減輕糖尿病視網膜微血管病變，但糖眼寧改善糖網病的作用及機制仍需進一步明確。既往認為，視網膜細胞在高血糖條件下處于凋亡狀態，導致嚴重的微血管損傷，破壞了血-視網膜屏障[5]。但與細胞凋亡對比，細胞焦亡作為一種新的程序性死亡方式發生得更早，而Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體是引起焦亡的關鍵[6]。因此，本研究在建立糖尿病大鼠模型基礎上，探討糖眼寧對視網膜NLRP3炎癥小體的調控，以及其對NLRP3炎癥小體所誘導的視網膜細胞焦亡的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠60只（8周齡，體質量200～250 g），由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001。飼養于首都醫科大學SPF級動物房，在控溫（22～26℃）、控濕（60%～70%）、控光（光照12 h/d，8∶00～20∶00）的安靜環境下飲食。

1.2 藥物與試劑糖眼寧顆粒（組成：菊花、枸杞子、生黃芪、太子參、地黃、山藥、山茱萸、丹參、三七等），購自北京康仁堂藥業有限公司。羥苯磺酸鈣膠囊（導升明，奧地利依比威藥品有限公司，批號：H20140641）。鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；兔多克隆BRCC36抗體（美國Thermo公司）；兔單克隆NLRP3抗體、兔單克隆消皮素D（GSDMD）抗體（美國Abcam公司）；小鼠單克隆凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）抗體、小鼠單克隆半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體（Pro-Caspase-1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）抗體（美國Santa公司）；β-actin（美國CST公司）；山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）、山羊抗鼠IgG（美國Immunoway公司）；異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；4%組織細胞固定液（北京索萊寶科技有限公司）；電鏡固定液（武漢Servicebio公司）；二甲苯、鹽酸乙醇、樹膠、磷酸緩沖液、鋨酸溶液、丙酮、環氧樹脂、醋酸鈾、檸檬酸鉛等，由首都醫科大學病理實驗中心提供。

1.3 儀器電子天平（美國奧豪斯公司）；羅氏卓越型血糖儀（德國羅氏公司）；R500小動物通用型麻醉機（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；RM2235手動輪轉式切片機、DMi8顯微鏡、LEICA DM LB2型顯微照相系統（德國Leica公司）；JEM-2100透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Motic B5顯微攝像系統（中國麥克奧迪公司）；全自動生化分析儀7600（日本Hitachi公司）。

1.4 分組、動物造模與給藥選取SPF級SD雄性大鼠60只，隨機分為正常組（10只）和造模組（50只）。正常組注射等量的溶劑檸檬酸緩沖液（pH 4.5），并喂以正常飲食。造模組大鼠經腹腔注射鏈脲佐菌素55 mg/kg制備糖尿病大鼠模型，并持續高脂飼料誘導，72 h后檢測隨機空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功[7]。將造模成功后的大鼠隨機分為模型組，導升明組及糖眼寧高、中、低劑量組，每組10只。分組后次日開始給藥，根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”[7]計算大鼠灌胃劑量。糖眼寧高、中、低劑量組大鼠分別給予10.8、5.4、2.7 g·kg-1·d-1的糖眼寧沖劑，導升明組大鼠給予導升明0.135 g·kg-1·d-1混懸液，以上各藥物用蒸餾水稀釋成等體積10 mL/kg液體。正常組和模型組采用等體積生理鹽水灌胃，各組連續灌胃給藥12周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 大鼠血糖和體質量觀察灌胃后每4周稱體質量、尾尖取血檢測空腹血糖。

1.5.2 視網膜組織檢測 大鼠取血后隨即摘除眼球制作含有視網膜的眼杯，按要求放置于40 g/L的多聚甲醛、25 g/L的戊二醛中固定或過液氮轉-80℃冰箱凍存，分別用于視網膜組織形態學觀察、免疫組織化學和蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測。

1.5.2.1 蘇木素-伊紅染色法觀察視網膜組織病理形態 將上述固定好的視網膜組織制成石蠟切片，常規脫蠟、水化后浸入蘇木素染液中染色3～5 min，再次用蒸餾水洗去玻片浮色，梯度乙醇溶液脫水后光鏡下觀察視網膜各層結構和病理改變，并拍照。

1.5.2.2 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d UTP缺口末端標記（TUNEL）染色法觀察視網膜組織細胞凋亡情況 隨機抽取組織石蠟切片，常規脫蠟脫水后按TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書操作。50 g/L牛血清白蛋白（BAS）封閉30 min，加入TUNEL反應液，37℃結合2 h；加Converter-POD反應液，37℃反應30 min，3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）顯色液室溫反應約10 min；透明封片，鏡檢。經TUNEL染色標記細胞核呈現出棕黃色或者棕褐色染色的細胞為陽性細胞，細胞核藍染的細胞是蘇木素復染的陰性細胞。使用ImageJ軟件觀察視網膜組織細胞DNA斷裂在各層的分布，判斷視網膜神經-血管單位中神經與血管損傷的狀態。

1.5.2.3 免疫組織化學法檢測視網膜組織ASC表達 隨機抽取組織石蠟切片，常規脫蠟、脫水清洗后，放置于3%過氧化氫溶液中室溫下孵育10 min。5%BAS室溫下封閉20 min，清洗切片加入50μL稀釋的一抗（1∶100）進行ASC免疫組織化學染色。常規清洗后滴加50μL新鮮配制的DAB溶液鏡于鏡下控制顯色。常規清洗、封片，使用IPP軟件觀察并分析各組大鼠視網膜內ASC陽性細胞染色面積百分比。

1.5.2.4 Western Blot法檢測視網膜組織中焦亡相關蛋白表達 將視網膜組織加入裂解液裂解，高速離心后收集上清液，完成蛋白提取。用二喹啉甲酸（BCA）法對提取的視網膜蛋白進行定量。制備10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠，每孔加入20μL蛋白樣品進行蛋白電泳。轉膜后，加入BRCC36（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、pro-Caspase-1（1∶500）、Caspase-1（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）等一抗稀釋液4℃孵育過夜。洗膜后加入與一抗同種屬的二抗稀釋液（1∶5 000）孵育2 h，電化學發光（ECL）法暗室曝光，掃描膠片后用圖像分析軟件分析目標條帶，獲得目的蛋白表達量。

1.6 統計方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，各組數據均為計量資料，以均值±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）和LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、空腹血糖比較表1結果顯示：給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠體質量趨于降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；給藥4周后，與模型組比較，導升明組及糖眼寧低、中劑量組大鼠體質量變化差異無統計學意義（P＞0.05），糖眼寧高劑量組大鼠體質量持續增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量比較Table 1 Comparison of body mass of rats in various groups （±s，g）

表1 各組大鼠體質量比較Table 1 Comparison of body mass of rats in various groups （±s，g）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組導升明組糖眼寧低劑量組糖眼寧中劑量組糖眼寧高劑量組給藥12周417.5±3.5 263.8±8.4①311.4±5.9 398.1±10.0 309.2±5.7 305.3±4.3②鼠數/只10 10 10 10 10 10給藥0周228.8±6.68 228.6±5.90 230.7±5.90 230.6±6.30 229.9±4.00 231.4±6.60給藥4周321.6±3.6 288.9±7.8①308.5±6.5 327.0±6.2 313.3±8.5 314.5±6.9②給藥8周381.7±5.9 289.3±6.1①312.6±9.7 356.2±3.1 310.0±6.1 313.1±9.4②

表2結果顯示：與正常組比較，模型組隨機空腹血糖水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，導升明組及糖眼寧高、中、低劑量組空腹血糖水平無明顯降低，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose levels of rats in various groups （±s，mmol·L-1）

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose levels of rats in various groups （±s，mmol·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較

組別正常組模型組導升明組糖眼寧低劑量組糖眼寧中劑量組糖眼寧高劑量組給藥12周4.98±0.44 32.16±1.20①32.23±0.95 32.24±1.10 31.79±0.80 29.76±0.89鼠數/只10 10 10 10 10 10給藥0周5.31±0.61 30.56±1.80①28.78±0.50 28.83±0.36 28.79±0.57 25.4±0.42給藥4周4.97±0.78 30.22±1.10①30.96±1.10 31.43±1.10 31.68±1.00 28.29±0.38給藥8周5.76±0.50 30.54±1.50①30.21±0.76 31.29±1.30 31.35±1.17 29.09±0.49

2.2 各組大鼠視網膜組織結構比較圖1結果顯示：正常組大鼠視網膜組織各層結構清晰，細胞形態正常，排列有序；模型組大鼠視網膜組織各層細胞明顯減少，出現萎縮，可見滲漏血管樣結構；導升明組大鼠視網膜組織水腫，內、外核層排列紊亂，散在增生血管；糖眼寧各劑量組大鼠視網膜組織水腫較導升明組減輕，其中，高劑量組各層結構清晰，較導升明組明顯改善。

圖1 各組大鼠視網膜組織結構比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of retinal tissue structure in various groups（by HE staining，×400）

2.3 各組大鼠視網膜細胞凋亡情況比較圖2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠視網膜凋亡細胞染色明顯增強，其中，神經節細胞層、內顆粒層最為明顯；與模型組比較，各治療組大鼠視網膜凋亡細胞染色均不同程度減弱，其中，糖眼寧高劑量組內核層、外核層改善最為明顯。結果表明，糖眼寧能夠改善糖尿病大鼠視網膜細胞損傷，尤其對神經節細胞層的保護最為明顯。

圖2 各組大鼠視網膜細胞凋亡情況比較（TUNEL染色，×400）Figure 2 Comparison of retinal cell apoptosis in various groups（by TUNEL staining，×400）

2.4 各組大鼠視網膜內NLRP3炎性小體活化程度比較圖3結果顯示：與正常組[（5.45±1.94）%]比較，模型組[（67.412±2.37）%]大鼠視網膜內凋亡相關的斑點樣蛋白（ASC）免疫染色程度明顯增強，且集中表達于視網膜各內層和外層的視細胞層，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，導升明組[（55.82±3.43）%]，糖眼寧低劑量組[（55.637±3.72）%]，糖眼寧中劑量組[（50.242±3.93）%]，糖眼寧高劑量組[（48.11±3.14）%]大鼠視網膜內ASC免疫染色程度均減弱或下調，差異有統計學意義（均P＜0.05）。結果表明，糖眼寧能夠抑制糖尿病大鼠視網膜內NLRP3炎性小體的活化。

圖3 各組大鼠視網膜內NLRP3炎性小體活化程度比較（免疫組織化學法，×400）Figure 3 Comparison of activation degree of NLRP3 inflammasome in retina of rats in various groups（by immunohistochemical method，×400）

2.5 各組大鼠視網膜中焦亡相關蛋白表達比較圖4結果顯示：與正常組比較，模型組焦亡關鍵蛋白NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、BRCC36表達明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠視網膜內焦亡 關 鍵 蛋 白NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、BRCC36表達均減弱或下調，差異有統計學意義（均P＜0.05）。結果表明，糖眼寧能夠明顯抑制糖尿病大鼠視網膜細胞焦亡。

圖4 各組大鼠視網膜中焦亡相關蛋白表達比較（Western Blot法）Figure 4 Comparison of pyroptosis related protein expression in retina of rats in various groups（by Western Blot）

3 討論

糖尿病視網膜病變不僅是微血管病變，還是一種低、中度炎癥反應[8]，主要表現為白細胞的聚集和邊流、炎癥因子分泌增加等[9]。在高血糖狀態下，視網膜各種炎癥因子分泌的增加導致炎癥風暴損傷視網膜的血管和神經單位[10]，出現微血管神經細胞、周細胞、內皮細胞凋亡等[11-12]。因此，炎癥反應被認為是糖尿病視網膜病變的發病機制之一[13]。NLRP3炎癥小體（inflammasome）作為炎癥反應中重要的組成部分，由胞內固有免疫受體Nod樣受體（NLRs）、ASC和Pro-Caspase-1組成，能夠誘導促炎因子白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素18（IL-18）的成熟和分泌。其在細胞中的活化分為啟動和激活2個過程，當NLRP3翻譯后被泛素標記則不能進行寡聚化，直到去泛素酶BRCC36使其去泛素化才具有活性[14]。雖然NLRP3激活的過程多樣，但始終與ASC寡聚化介導相關[15]。本質上，炎癥（inflammation）是機體對組織損傷的一種快速而協調的反應，過猶不及。本研究通過免疫組織化學法和Western Blot法檢測發現，除正常組外，其他各組大鼠視網膜細胞ASC和BRCC36均已激活，NLRP3炎癥小體表達均不同程度增強。其中，糖眼寧高劑量組BRCC36、ASC、NLRP3炎癥小體表達均較模型組下調，表明大鼠成模后隨著糖尿病病程的進展，視網膜細胞在高血糖條件下受到損傷，出現了炎癥反應。當炎癥反應過度造成細胞DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現缺口時，則會被TUNEL染色標記。NLRP3炎癥小體過表達的組別視網膜細胞凋亡染色增強，表明視網膜細胞在炎癥因子的刺激下已經出現程序性死亡。

NLRP3過度活化的結果可導致細胞焦亡[16]。焦亡屬于炎癥性死亡途徑，按激活機制可分為依賴Caspase-1的經典途徑和依賴Caspase-4、-5、-11的非經典途徑[17-18]。經典途徑主要特征為NLRP3炎癥小體及其下游效應因子Caspase-1活化，活化的Caspase-1在剪切GSDMD誘導細胞膜穿孔的同時，剪切Pro-IL-1β、Pro-IL-18形成IL-1β和IL-18釋放到胞外擴大炎癥反應[19]。而GSDMD基因敲除，則Caspase-1不會介導細胞焦亡的發生[20]。本研究結果顯示：與模型組比較，糖眼寧高劑量組Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平明顯降低。

糖眼寧由枸杞子、菊花、地黃、山萸肉、生黃芪、三七等組成，具有益氣養陰、通絡明目的功效，主要用于治療氣陰兩虛、絡脈瘀阻型糖尿病。本研究通過視網膜組織病理切片直觀反映糖尿病大鼠視網膜損傷程度，進而評價各治療組對血-視網膜屏障的保護作用。結果顯示：當造模達到12周時，大鼠已經出現輕、中度的視網膜組織損傷，主要表現為層間結構排列紊亂。在進行藥物干預后，各治療組大鼠視網膜組織損傷與模型組比較均得到不同程度的改善，其中糖眼寧高劑量組改善作用最明顯。結果表明，糖眼寧能夠改善糖尿病大鼠的一般生理狀態，有效抑制大鼠視網膜中NLRP3炎癥小體活化減輕炎性反應，降低焦亡關鍵蛋白的表達。

綜上所述，糖眼寧可減輕糖尿病大鼠視網膜炎癥反應，抑制視網膜組織細胞的焦亡，延緩了糖尿病視網膜微血管損傷進程，維護了血-視網膜屏障的完整性。