當歸多糖對妊娠期易栓癥大鼠的抗炎作用及對凝血功能的影響

麻卲?，李曉茹，呂志華，吳紀珍

（1.鄭州市第一人民醫院婦科，河南鄭州 450000；2.河南省人民醫院危重癥醫學科，河南鄭州 450000）

易栓癥是指由于抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等的遺傳性或獲得性缺陷者存在獲得性危險而容易發生血栓栓塞的疾病或狀態，主要臨床表現為血栓形成，血栓類型以靜脈血栓為主[1]。妊娠期婦女血容量增加，血流動力學改變，易發生靜脈血栓，同時凝血因子增加，纖溶活性降低，處于獲得性易栓狀態，導致易栓癥發病率較高，并增加妊娠并發癥，影響妊娠結局。目前，臨床對妊娠易栓癥的治療尚無統一定論，主要通過抗凝、抗血小板及溶栓等方法治療。因此，尋找安全、有效的治療途徑，對于改善妊娠期高凝狀態具有重要意義。當歸多糖是當歸的主要成分，具有改善血液系統、促進免疫、抗腫瘤、抗輻射的作用[2-3]。當歸多糖不僅影響動物機體的造血系統，而且具有雙向調節凝血的功效[4]。研究發現，當歸多糖主要影響內源性凝血系統，延長凝血酶活時間，產生抗凝血作用，同時，促進血小板聚集，發揮止血功能[5]。但是，目前當歸多糖在治療妊娠期易栓癥中發揮的作用尚不完全明確，因此，本研究擬通過建立妊娠期易栓癥大鼠模型，觀察當歸多糖對大鼠妊娠期易栓癥的抗炎作用及對凝血功能的影響，以期為臨床治療奠定基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級6周齡大鼠120只，雌性85只，雄性35只，體質量180～200 g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，動物生產許可號：SCXK（滬）2019-0002。購買后飼養于河南省中醫藥研究院，使用許可證號：SYXK（豫）2019-0001，飼養于溫度23～25℃，濕度60%～65%環境中，晝夜12 h交替適應性飼養。

1.2 藥物、試劑與儀器當歸多糖（北京索萊寶科技有限公司，批號：SA8740）。脂多糖（LPS）（美國Sigma-Aldrich公司）；白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、基質細胞衍生因子1（SDF-1）、血漿D-二聚體（D-D）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、組織因子（TF）、纖維蛋白原（FIB）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海晶抗生物公司）。ST-360酶標儀（科華生物公司）。

1.3 建模雌性大鼠隨機留取15只為正常組。將發情期的70只雌性大鼠與雄性大鼠合籠（2∶1），以發現陰道栓記為妊娠0 d。妊娠7 d，將63只懷孕雌性大鼠用3%戊巴比妥鈉按照30 mg/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射30 mg/kg的LPS，誘導大鼠產生易栓癥[6]。若應用多普勒超聲監測血流有血栓形成，則判斷為建模成功[7]。其中，死亡大鼠7只，流產大鼠7只，易栓癥大鼠49只。

1.4 分組與干預將建模成功的49只雌性大鼠隨機分為模型組13只，當歸多糖低、中和高劑量組各12只。自建模成功后24 h開始，參照文獻劑量[8]，當歸多糖低、中和高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg當歸多糖，1次/d，連續7 d，模型組灌胃等體積生理鹽水，干預頻次同上。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 測量出血、凝血時間末次給藥30 min后，用斷尾法[9]測定出血時間。固定大鼠后，將其尾部固定并垂直，從大鼠尾部3 mm處剪斷，使血液自行流出，每10 s用濾紙吸1次尾部血液，直至血液吸不出為止，記錄斷尾至出血停止時間。

末次給藥30 min后，用玻片法[10]測定凝血時間。將5號注射針頭通過眼眶刺入大鼠眼球后靜脈叢，使血液自行流出，用濾紙吸去第1滴血，而后將血液滴在清潔的玻片上，使血液直徑在5～10 mm，每15 s用清潔干燥的針頭由血液邊緣向內挑動1次，直至能挑起纖維蛋白絲為止，記錄血滴到玻片到能挑起纖維蛋白絲的時間。

1.5.2 ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平麻醉大鼠，腹腔靜脈取血以4 000 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min后，分別提取血清和血漿（留待下一步檢測）于-20℃保存。取血清用ELISA試劑盒測定IL-6、TNF-α、SDF-1水平。按照ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值，通過繪制標準曲線計算得出IL-6、TNF-α和SDF-1濃度。

1.5.3 ELISA法檢測血漿TF、AT-Ⅲ、D-D、FIB水平取保存于-20℃的血漿，按照ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標儀測定450 nm波長處的OD值，通過繪制標準曲線計算得出TF、AT-Ⅲ、D-D、FIB濃度。

1.5.4 HE染色法觀察大鼠含血栓靜脈管壁病理變化處死大鼠，打開腹腔，解剖左腎靜脈以下下腔靜脈至左右髂總靜脈匯合處，切取下腔靜脈及其內部血栓。10%甲醛固定36 h，流水沖洗，9%硝酸脫鈣，閉光過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡觀察。

1.6 統計方法采用SPSS 24.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠出血、凝血時間比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組出血時間增加，凝血時間減少（P＜0.05）；與模型組比較，當歸多糖低、中、高劑量組出血時間減少，凝血時間增加（P＜0.05）；與當歸多糖低劑量組比較，當歸多糖中、高劑量組出血時間減少，凝血時間增加（P＜0.05）；與當歸多糖中劑量組比較，當歸多糖高劑量組出血時間減少，凝血時間增加（P＜0.05）。

表1 各組大鼠出血、凝血時間比較Table1 Comparison of bleeding and coagulation time between various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠出血、凝血時間比較Table1 Comparison of bleeding and coagulation time between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與當歸多糖低劑量組比較；④P＜0.05，與當歸多糖中劑量組比較

凝血時間/s 246.13±24.97 99.46±10.25①126.79±12.89①②175.03±18.51①②③210.31±21.64①②③④29.527＜0.001組別正常組模型組當歸多糖低劑量組當歸多糖中劑量組當歸多糖高劑量組F值P值鼠數/只15 13 12 12 12出血時間/s 89.58±9.84 267.02±26.87①223.96±23.68①②183.87±18.61①②③134.05±14.42①②③④43.138＜0.001

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組IL-6、TNF-α、SDF-1水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，當歸多糖低、中、高劑量組IL-6、TNF-α、SDF-1水平降低（P＜0.05）；與當歸多糖低劑量組比較，當歸多糖中、高劑量組IL-6、TNF-α、SDF-1水平降低（P＜0.05）；與當歸多糖中劑量組比較，當歸多糖高劑量組IL-6、TNF-α、SDF-1水平降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平比較Table 2 Comparison of levels of serum IL-6，TNF-αand SDF-1 between various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平比較Table 2 Comparison of levels of serum IL-6，TNF-αand SDF-1 between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與當歸多糖低劑量組比較；④P＜0.05，與當歸多糖中劑量組比較

SDF-1/（μg·mL-1）236.31±25.27 438.37±42.89①378.54±38.03①②325.41±32.98①②③279.58±28.03①②③④34.648＜0.001組別正常組模型組當歸多糖低劑量組當歸多糖中劑量組當歸多糖高劑量組F值P值鼠數/只15 13 12 12 12 IL-6/（μg·mL-1）121.62±12.53 319.18±27.59①276.38±28.10①②231.46±23.74①②③186.74±19.02①②③④41.257＜0.001 TNF-α/（μg·mL-1）206.62±21.03 398.91±40.31①337.52±34.21①②283.67±29.32①②③241.68±24.96①②③④39.523＜0.001

2.3 各組大鼠血漿TF、D-D、AT-Ⅲ、FIB水平比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組血漿TF、D-D、FIB水平升高，AT-Ⅲ水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，當歸多糖低、中、高劑量組血漿TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高（P＜0.05）；與當歸多糖低劑量組比較，當歸多糖中、高劑量組血漿TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高（P＜0.05）；與當歸多糖中劑量組比較，當歸多糖高劑量組血漿TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血漿TF、D-D、AT-Ⅲ、FIB水平比較Table 3 Comparison of plasma TF，D-D，AT-Ⅲ，FIB levels between various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠血漿TF、D-D、AT-Ⅲ、FIB水平比較Table 3 Comparison of plasma TF，D-D，AT-Ⅲ，FIB levels between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與當歸多糖低劑量組比較；④P＜0.05，與當歸多糖中劑量組比較

FIB/（μg·L-1）267.65±27.53 385.75±39.16①352.53±36.17①②327.67±33.64①②③287.63±29.17①②③④30.283＜0.001組別正常組模型組當歸多糖低劑量組當歸多糖中劑量組當歸多糖高劑量組F值P值鼠數/只15 13 12 12 12 TF/（μg·mL-1）143.58±14.54 298.97±30.05①266.26±27.12①②223.46±23.17①②③185.67±19.12①②③④32.734＜0.001 D-D/（μg·mL-1）169.31±17.13 326.53±33.21①276.57±27.96①②238.63±24.45①②③197.67±20.03①②③④31.468＜0.001 AT-Ⅲ/（μg·mL-1）246.68±25.14 89.65±9.15①120.57±12.26①②168.53±17.65①②③197.89±20.26①②③④25.432＜0.001

2.4 各組大鼠含血栓靜脈管壁病理變化比較圖1結果顯示：正常組血管內壁正常，無炎性細胞浸潤；模型組血管內壁增生，大量鈣鹽及含鐵血黃素析出，新生毛細血管數量增多，血栓形成；當歸多糖低劑量組血栓減少，血小板小梁增多聚集成堆，少許纖維素樣成分析出；當歸多糖中劑量組血管壁邊緣少許白色血栓形成；當歸多糖高劑量組僅有微量血小板血栓形成。

圖1 各組大鼠含血栓靜脈管壁病理變化比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of pathological changes of vein wall with thrombus in various groups of rats（by HE staining，×100）

3 討論

當血管內皮細胞受損，誘導內皮細胞中TF表達，TF啟動外凝血途徑，促進內凝血途徑活化，引起易栓癥形成[11]。隨著醫學界研究的深入，專家們希望通過改變某一節點，使機體恢復穩態，以改善高凝狀態，預防血栓形成[12]。當歸具有廣泛的藥理作用，在神經系統、免疫系統和循環系統等方面研究比較深入，但其在抗炎、抗血栓形成等方面尤其是對免疫炎性易栓癥的抑炎作用研究較少[13]。當歸多糖是當歸的主要成分之一，本研究主要探究當歸多糖對妊娠期易栓癥大鼠的抗炎作用及對凝血功能的影響。

當歸多糖具有明顯的抗炎作用。體外實驗研究顯示，當歸多糖可通過抑制炎癥反應，減輕神經元細胞炎性損傷[14]；動物實驗研究表明，其可顯著降低IL-6、TNF-α等促炎因子水平，對關節炎大鼠具有明顯的治療作用[15]。本研究結果顯示：當歸多糖各劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α、SDF-1水平明顯低于模型組，提示當歸多糖具有抗易栓癥炎癥作用。當歸是常用活血補血中藥，當歸多糖作為其主要的活性成分，可通過增強血紅蛋白和紅細胞等血液學參數，對貧血白化大鼠具有明顯的造血作用[16]，提示其在血液循環中具有重要作用。血栓發展始終伴隨著炎癥反應，兩者之間存在相互促進作用。IL-6、TNF-α等炎性介質可促進機體高凝狀態，導致血栓形成；同時，血栓形成過程中，凝血酶及相關因子可進一步誘導炎癥反應。TF參與凝血過程，與靜脈血栓形成密切相關；D-D水平變化與體內高凝狀態和纖溶亢進有關，其水平升高表明血栓形成和纖溶發生；FIB可促使紅細胞聚集，是影響血漿黏度的重要因素；AT-Ⅲ是重要的抗凝因子，在保持體內凝血和纖溶平衡中發揮了重要作用。本研究結果顯示，當歸多糖治療組較模型組血漿TF、D-D、FIB水平降低，AT-Ⅲ水平升高，且含血栓靜脈管壁病理變化較模型組明顯減輕，提示當歸多糖對易栓癥具有抗血栓作用。

當歸多糖是當歸中促進造血的有效成分，在外周血細胞減少和骨髓受到抑制時，能增加外周血紅細胞、白細胞、血紅蛋白及骨髓有核細胞數，促進生血[17-18]。當歸多糖不僅具有造血功能，而且具有雙向調節凝血的功能，通過影響內源性凝血系統，延長凝血酶活化時間，產生抗凝血作用，同時，促進血小板聚集，發揮止血功能。已有研究證實，當歸多糖具有活血祛瘀功能，可調節血瘀證大鼠凝血功能和血液流變學指標，改善血管內皮損傷[19]。另有研究發現，當歸多糖及其硫酸酯能夠顯著延長凝血時間，縮短出血時間，具有較強的抗凝血和止血作用[20]。本研究得到相似結果，當歸多糖治療組出血時間減少，凝血時間增加，提示當歸多糖對易栓癥具有抗凝血作用。

綜上所述，當歸多糖在大鼠妊娠期易栓癥中發揮抗炎作用，且具有抗凝血、抗血栓功效，可為臨床治療妊娠期易栓癥提供理論依據。