白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用及對(duì)免疫功能的影響

李元昆，魯笑欽，胡濱，屈紅杰，顧曉荔

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，河南鄭州 450014）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer）為婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年攀升，并呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性的生殖健康[1-2]。尋找中藥抗腫瘤活性成分和明確其抗腫瘤作用機(jī)制成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。白藜蘆醇（resveratrol）為非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于虎杖、藜蘆、葡萄等藥用植物及食物當(dāng)中，具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[3-4]。白藜蘆醇對(duì)人宮頸癌AN3CA細(xì)胞，子宮內(nèi)膜癌HEC-1B、KLE及Ishikawa細(xì)胞的增殖以及兩者移植瘤小鼠模型腫瘤的生長均有較好的抑制作用[4]。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫炎癥密切相關(guān)，由于腫瘤微環(huán)境慢性炎癥的存在，Toll樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子88（MyD88）信號(hào)通路可被異常激活，誘導(dǎo)多種促炎因子和抗凋亡蛋白的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[5]。那么，靶向作用于TLR4/MyD88信號(hào)通路，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌患者免疫功能可能可以有效地抑制子宮內(nèi)膜的增殖侵襲，因此，本研究構(gòu)建人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，探討白藜蘆醇對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長及TLR4/MyD88介導(dǎo)的免疫炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供更多的藥效研究基礎(chǔ)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞SPF級(jí)BALB/c-nu裸鼠，4～6周齡，雄性，30只，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：202011179；動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2020-1-003；動(dòng)物批次號(hào)：202007013。人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。該實(shí)驗(yàn)方案已經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑白藜蘆醇（純度≥98%，5 mg/支）購自美國Sigma公司，批號(hào)：20192-307；注射用順鉑（10 mg/支）購自山東齊魯制藥有限公司，批號(hào)：201986509。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD4抗體、PE-CD8a抗體、別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin，APC）標(biāo)記的CD3e抗體均購自美國BD公司；兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠MyD88單克隆抗體、兔抗鼠核因子κB（NF-κB）p65單克隆抗體和兔抗鼠GAPDH單克隆抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 儀器IX73倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯光學(xué)有限公司；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；B5060EK CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Hearers公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自美國Bio-Tek生物儀器有限公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含10%熱滅活的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，迅速置于飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行傳代。收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.5%胰蛋白酶消化傳代，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成濃度為1.8×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。

1.5 子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠模型的建立將配制好的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞混懸液接種于實(shí)驗(yàn)裸鼠的右腋部皮下，每只裸鼠接種0.1 mL。接種5 d后，可觀察到裸鼠接種癌細(xì)胞的部位出現(xiàn)扁平或橢圓形的包塊，并且逐漸增大，視為建立子宮內(nèi)膜癌皮下移植瘤模型成功[6]。

1.6 動(dòng)物分組與給藥方法將造模成功的30只BALB/c-nu裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，順鉑組和白藜蘆醇低、中、高劑量組，每組6只。在造模第8天，皮下移植瘤生長至1 cm左右時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)，順鉑組腹腔注射1 mL的順鉑（2 mg·kg-1），白藜蘆醇低、中、高劑量組分別腹腔注射1 mL劑量為2.5、5、10 mg·kg-1的白藜蘆醇，模型組給予等體積的生理鹽水腹腔注射，每天1次，連續(xù)給藥21 d。

1.7 觀察指標(biāo)與方法

1.7.1 測(cè)定子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠腫瘤體積、抑瘤率及免疫器官指數(shù)各組荷瘤裸鼠在停藥后第2天處死前，每隔3 d使用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只荷瘤鼠腫瘤的短徑（b）與長徑（a），計(jì)算腫瘤體積[V＝（a×b2）×1/2]，并繪制移植瘤生長曲線。停藥后第2天，眼眶收集靜脈血后，無菌操作剝離腫瘤、胸腺和脾臟組織，稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。抑瘤率=（m模型組平均瘤質(zhì)量-m實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）/m模型組平均瘤質(zhì)量×100%；胸腺指數(shù)=m胸腺/m體質(zhì)量；脾臟指數(shù)=m脾臟/m體質(zhì)量[7]。

1.7.2 ELISA法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ及IL-2含量收集各組荷瘤裸鼠靜脈血，分離血清，于4℃靜置20 min后，離心取上清，分裝后于-80℃保存待測(cè)。采用ELISA法，按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書中的操作步驟，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處吸光度（OD）值，計(jì)算血清中TNF-α、IFN-γ及IL-2含量[8]。

1.7.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷瘤裸鼠外周血中CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞水平參考文獻(xiàn)研究[9]的方法制備外周血細(xì)胞混懸液，收集的外周血，加入3 mL紅細(xì)胞裂解液低溫裂解10 min，隨后離心（300 r/min，離心半徑15 cm）10 min；分離上清后再次加入3 mL紅細(xì)胞裂解液低溫裂解，再次低溫離心（300 r/min，離心半徑15cm）10 min后，使用PBS重懸收集的細(xì)胞沉淀；吸取外周血細(xì)胞懸液，加入500μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入APC-CD3e、PE-CD4和PE-CD8a抗體，避光孵育15 min；低溫離心（300 r/min，離心半徑15 cm）10 min后，分離上清，PBS洗滌后使用多聚甲醛溶液定容；過350目濾網(wǎng)后，進(jìn)行流式上機(jī)。以CD3e+CD8+雙陽性細(xì)胞亞群表示CD8+T細(xì)胞所占比例，以CD3e+CD4+雙陽性細(xì)胞亞群百分比表示CD4+T細(xì)胞所占比例，檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞水平，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.7.4 測(cè)定子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠免疫功能

1.7.4.1 檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷功能 將分離得到的脾臟置于200目滅菌篩網(wǎng)上碾壓擠碎，加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液后過濾，制備單脾細(xì)胞懸液，使用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞。傳代培養(yǎng)至濃度1×106個(gè)/mL的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞。在96孔板中加入100μL K562細(xì)胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，隨后加入100μL效應(yīng)細(xì)胞，效靶比為50∶1，同時(shí)另設(shè)單純靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞孔，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20μL的四甲基偶氮唑鹽（MTT）（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)3 h，再加入100μL二甲基亞砜（DMSO），最后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞抑瘤率，評(píng)價(jià)NK細(xì)胞殺傷功能。細(xì)胞抑瘤率=1-（OD實(shí)驗(yàn)孔-OD單純效應(yīng)孔）/OD靶細(xì)胞孔×100%[10]。

1.7.4.2 檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力 按上述方法制備單脾細(xì)胞懸液，使用RPMI-1640培養(yǎng)液漂洗2次后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，在96孔板中加入100μL單脾細(xì)胞懸液和100μL的刀豆蛋白（10μg/mL）作為實(shí)驗(yàn)孔，對(duì)照孔加入100μL單脾細(xì)胞懸液和100μL的RPMI-1640培養(yǎng)液，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入10μL的MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)[11]。

1.7.4.3 檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能 處死各組裸鼠后，使用PBS緩沖液灌洗裸鼠腹腔并收集灌洗液，隨后離心（300 r/min，離心半徑15 cm）10 min。然后收集細(xì)胞，使用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，在96孔板中加入200μL腹腔巨噬細(xì)胞懸液，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除未貼壁的細(xì)胞，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入50μL中性紅溶液（3 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用PBS緩沖液漂洗后，加入200μL細(xì)胞裂解液，隨后使用酶標(biāo)儀在540 nm波長處測(cè)各孔的OD值[12]。

1.7.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)脾臟組織中TLR4/MyD88信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平分離上述各組裸鼠的脾臟組織，制備脾臟組織勻漿，放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解后提取脾臟組織總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白定量。隨后常規(guī)上樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后依次加入TLR4（1∶1 000）、MyD88（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）及GAPDH（1∶1 000）等一抗稀釋液，4℃孵育過夜[13]。辣根過氧化物酶標(biāo)志鼠抗兔二抗稀釋液（1∶2 000），化學(xué)底物發(fā)光法顯色，圖像掃描分析。采用Image-QuaNT軟件測(cè)量其光密度，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響在接種20 d后，順鉑組和白藜蘆醇高劑量組的腫瘤體積顯著低于模型組（P＜0.05）；在接種24 d后，白藜蘆醇中劑量組的腫瘤體積亦顯著低于模型組（P＜0.05）；在接種全程，白藜蘆醇低劑量組的腫瘤體積與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖1。

圖1 各組荷瘤裸鼠腫瘤體積變化圖Figure 1 Tumor volume changes of tumor-bearing nude mice in each group

各組荷瘤裸鼠在接種28 d后腫瘤實(shí)物如圖2所示。

圖2 接種28 d后荷瘤裸鼠腫瘤實(shí)物圖Figure 2 Physical image of tumor-bearing nude mice 28 days after transplantation

5組荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，順鉑組和白藜蘆醇低、中、高劑量組的腫瘤質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，白藜蘆醇低、中、高劑量組的腫瘤質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；白藜蘆醇各劑量組組間腫瘤質(zhì)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著白藜蘆醇劑量的增加，抑瘤率明顯提高。具體結(jié)果見表1。

表1 各組荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的比較Table 1 Comparison of tumor mass and tumor inhibition rate in tumor-bearing nude mice of various groups（±s）

表1 各組荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的比較Table 1 Comparison of tumor mass and tumor inhibition rate in tumor-bearing nude mice of various groups（±s）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與順鉑組比較；③P＜0.05，與白藜蘆醇低劑量組比較；④P＜0.05，與白藜蘆醇中劑量組比較

抑瘤率/%—78.21±3.74 15.14±2.43②45.33±3.68②③67.65±4.17②③④組別模型組順鉑組白藜蘆醇低劑量組白藜蘆醇中劑量組白藜蘆醇高劑量組鼠數(shù)/只66666腫瘤質(zhì)量/g 2.44±0.75 0.52±0.11①2.07±0.36①②1.31±0.42①②③0.78±0.23①②③④

2.2 白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠免疫器官指數(shù)的影響表2結(jié)果顯示，與模型組比較，順鉑組的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），白藜蘆醇中、高劑量組均顯著增加（P＜0.05），但白藜蘆醇低劑量組無顯著性差異（P＞0.05）。與順鉑組比較，白藜蘆醇低、中、高劑量組的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇中、高劑量組的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。白藜蘆醇中、高劑量組胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組荷瘤裸鼠免疫器官指數(shù)的比較Table 2 Comparison of immune organ index of tumorbearing nude mice in various groups （±s，mg·g-1）

表2 各組荷瘤裸鼠免疫器官指數(shù)的比較Table 2 Comparison of immune organ index of tumorbearing nude mice in various groups （±s，mg·g-1）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與順鉑組比較；③P＜0.05，與白藜蘆醇低劑量組比較

脾臟指數(shù)5.35±0.38 3.39±0.43①5.66±0.47②6.72±0.34①②③7.18±0.29①②③組別模型組順鉑組白藜蘆醇低劑量組白藜蘆醇中劑量組白藜蘆醇高劑量組鼠數(shù)/只66666胸腺指數(shù)1.82±0.31 1.02±0.26①1.95±0.22②2.47±0.33①②③2.76±0.28①②③

2.3 白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-2含量的影響表3結(jié)果顯示：與模型組比較，順鉑組和白藜蘆醇低、中、高劑量組的血清TNF-α、IFN-γ及IL-2含量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。與順鉑組比較，白藜蘆醇各劑量組的血清TNF-α、IFN-γ及IL-2含量均顯著增加（P＜0.05）。白藜蘆醇各劑量組血清TNF-α、IFN-γ及IL-2含量組間比較均有差異（P＜0.05），隨著白藜蘆醇劑量的增加，血清TNF-α、IFN-γ及IL-2含量明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組荷瘤裸鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-2含量的比較Table 3 Comparison of serum TNF-α，IFN-γand IL-2 contents in tumor-bearing nude mice of various groups（±s，ng·L-1）

表3 各組荷瘤裸鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-2含量的比較Table 3 Comparison of serum TNF-α，IFN-γand IL-2 contents in tumor-bearing nude mice of various groups（±s，ng·L-1）

①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與順鉑組比較；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，與白藜蘆醇低劑量組比較；⑦P＜0.05，⑧P＜0.01，與白藜蘆醇中劑量組比較

IL-2 2.65±0.11 3.17±0.16①3.52±0.22①③3.95±0.31①③⑤4.47±0.29①③⑤⑦組別模型組順鉑組白藜蘆醇低劑量組白藜蘆醇中劑量組白藜蘆醇高劑量組鼠數(shù)/只66666 TNF-α 315.76±27.16 358.25±18.76①418.39±38.25②④467.19±27.71②④⑤526.78±33.19②④⑥⑧IFN-γ 3.29±0.47 3.88±0.39①4.47±0.22①③4.88±0.26①③⑤5.48±0.37①③⑤⑦

2.4 白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平的影響表4、圖3結(jié)果顯示：與模型組比較，順鉑組CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），白藜蘆醇中、高劑量組的CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值均顯著增加（P＜0.05）、CD8+T細(xì)胞水平顯著降低（P＜0.05），白藜蘆醇低劑量組的CD4+/CD8+比值顯著增加（P＜0.05）、CD8+T細(xì)胞水平顯著降低（P＜0.05）、CD4+T細(xì)胞水平無顯著性差異（P＞0.05）。與順鉑組比較，白藜蘆醇各劑量組的CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值均顯著增加（P＜0.05）、CD8+T細(xì)胞水平顯著降低（P＜0.05）。白藜蘆醇各劑量組CD4+、CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD8+比值組間均有顯著性差異（P＜0.05），且隨著白藜蘆醇劑量的增加，CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值明顯增加、CD8+T細(xì)胞水平明顯降低（P＜0.05）。

圖3 各組荷瘤裸鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的流式散點(diǎn)圖Figure 3 Comparison of flow cytometry scatter diagram of T lymphocyte subsets in peripheral blood of tumor-bearing nude mice in various groups

表4 各組荷瘤裸鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較Table 4 Comparison of level of T lymphocyte subsets in peripheral blood of tumor-bearing nude mice in various groups （±s）

表4 各組荷瘤裸鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較Table 4 Comparison of level of T lymphocyte subsets in peripheral blood of tumor-bearing nude mice in various groups （±s）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與順鉑組比較；③P＜0.05，與白藜蘆醇低劑量組比較；④P＜0.05，與白藜蘆醇中劑量組比較

CD4+/CD8+0.72±0.15 0.76±0.27 1.01±0.28①②1.23±0.33①②③1.56±0.32①②③④組別模型組順鉑組白藜蘆醇低劑量組白藜蘆醇中劑量組白藜蘆醇高劑量組鼠數(shù)/只66666 CD4+/%17.39±3.67 15.98±1.82 18.67±2.77②21.54±3.25①②③23.18±3.78①②③④CD8+/%22.47±2.31 20.32±3.49 18.15±2.79①②16.89±1.98①②③13.76±2.67①②③④

2.5 白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠免疫功能的影響表5結(jié)果顯示：與模型組的淋巴細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞殺傷活性比較，順鉑組均降低（P＜0.05），白藜蘆醇中、高劑量組均增加（P＜0.05），白藜蘆醇低劑量組則無顯著性差異（P＞0.05）。與順鉑組比較，白藜蘆醇各劑量組的上述指標(biāo)均增加（P＜0.05）。白藜蘆醇各劑量組上述指標(biāo)組間比較也有顯著性差異，且隨著白藜蘆醇劑量的增加，淋巴細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞殺傷活性明顯提高。

表5 各組荷瘤裸鼠NK細(xì)胞殺傷活性、淋巴細(xì)胞增殖能力及巨噬細(xì)胞吞噬功能的比較Table 5 Comparison of killing activity of NK cells，proliferation ability of lymphocytes and phagocytic function of macrophages in tumor-bearing nude mice （±s）

表5 各組荷瘤裸鼠NK細(xì)胞殺傷活性、淋巴細(xì)胞增殖能力及巨噬細(xì)胞吞噬功能的比較Table 5 Comparison of killing activity of NK cells，proliferation ability of lymphocytes and phagocytic function of macrophages in tumor-bearing nude mice （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較；③P＜0.05，與順鉑組比較；④P＜0.05，與白藜蘆醇低劑量組比較；⑤P＜0.05，與白藜蘆醇中劑量組比較

NK細(xì)胞殺傷活性/%45.72±3.18 33.66±2.76①46.66±3.62③57.19±4.17②③④64.18±4.85②③④⑤組別模型組順鉑組白藜蘆醇低劑量組白藜蘆醇中劑量組白藜蘆醇高劑量組鼠數(shù)/只66666淋巴細(xì)胞增殖能力OD值0.45±0.03 0.32±0.02①0.47±0.04③0.56±0.05①③④0.68±0.05①③④⑤巨噬細(xì)胞吞噬功能OD值0.59±0.06 0.42±0.04①0.61±0.05③0.77±0.06①③④0.82±0.05①③④⑤

2.6 白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠脾臟中TLR4/MyD88信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響表6、圖4結(jié)果顯示：與模型組比較，順鉑組裸鼠脾臟中TLR4、MyD88及NF-κB p65的表達(dá)無顯著性變化（P＞0.05），白藜蘆醇低劑量組中TLR4的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）、MyD88及NF-κB p65的表達(dá)無顯著性變化（P＞0.05），白藜蘆醇中、高劑量組TLR4、MyD88及NF-κB p65的表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）。與順鉑組比較，白藜蘆醇低劑量組中TLR4的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）、MyD88及NFκB p65的表達(dá)無顯著性變化（P＞0.05），白藜蘆醇中、高劑量組TLR4、MyD88及NF-κB p65的表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）。白藜蘆醇各劑量組TLR4、MyD88及NF-κB p65表達(dá)的組間比較，有顯著性差異（P＜0.05），隨著白藜蘆醇劑量的增加，TLR4、MyD88及NF-κB p65的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。

圖4 各組荷瘤祼鼠脾臟TLR4、MyD88及NF-κB p65的Western Blot電泳圖Figure 4 Western Blot analysis of TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in spleen of each group

表6 各組荷瘤裸鼠脾臟TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的比較Table 6 Comparison of protein expression levels of TLR4，MyD88，NF-κB p65 in spleen in tumor-bearing nude mice of various groups （±s）

表6 各組荷瘤裸鼠脾臟TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的比較Table 6 Comparison of protein expression levels of TLR4，MyD88，NF-κB p65 in spleen in tumor-bearing nude mice of various groups （±s）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與順鉑組比較；③P＜0.05，與白藜蘆醇低劑量組比較；④P＜0.05，與白藜蘆醇中劑量組比較

NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量0.22±0.04 0.25±0.03 0.28±0.04 0.57±0.05①②③0.64±0.05①②③④組別模型組順鉑組白藜蘆醇低劑量組白藜蘆醇中劑量組白藜蘆醇高劑量組鼠數(shù)/只66666 TLR4相對(duì)表達(dá)量0.13±0.02 0.14±0.03 0.33±0.03①②0.45±0.04①②③1.05±0.05①②③④MyD88相對(duì)表達(dá)量0.14±0.02 0.16±0.02 0.19±0.03 0.35±0.03①②③0.67±0.04①②③④

3 討論

近年來，白藜蘆醇等天然化合物的抗腫瘤活性日益受到關(guān)注，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)出較好的抑制作用[14]。白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2等凋亡蛋白的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞株U14及人子宮內(nèi)膜癌AN3CA、Ishikawa等細(xì)胞株的增殖，誘導(dǎo)凋亡[15]。本研究中，白藜蘆醇能夠明顯降低Ishikawa細(xì)胞株移植瘤的生長速度，降低移植瘤的瘤體質(zhì)量，抑瘤率明顯增加，說明白藜蘆醇對(duì)于體內(nèi)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長同樣具有較好的作用，這與此前相關(guān)白藜蘆醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠抑制作用的報(bào)道相一致[16]。同時(shí)，白藜蘆醇還可以通過降低腫瘤組織巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子和微血管密度抑制宮頸癌移植瘤的生長[17]。因此，白藜蘆醇對(duì)于子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌等腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外均具有較好的抗腫瘤活性。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫炎癥密切相關(guān)，機(jī)體免疫功能的降低可致使腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[18]。胸腺和脾臟作為機(jī)體重要的免疫器官，兩者指數(shù)的高低在一定程度上反映了機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[19]。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇對(duì)于子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠的干預(yù)，能夠顯著增加其胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，表明白藜蘆醇可以有效防止子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠免疫器官萎縮及功能減退，維持和提高免疫功能。脾臟作為機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心組織，含有大量的淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及吞噬細(xì)胞[20]。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇能夠明顯提高荷瘤裸鼠脾臟中淋巴細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬功能及NK細(xì)胞殺傷活性，而陽性藥順鉑組荷瘤裸鼠的上述指標(biāo)卻顯著降低，再次表明白藜蘆醇的抗腫瘤作用與提高子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠免疫功能有關(guān)。

在腫瘤患者的免疫系統(tǒng)中，T淋巴細(xì)胞具有重要作用，CD4+等輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞能夠分泌IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子，刺激B細(xì)胞活化發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，CD8+等抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞則能夠分泌抑制因子，具有負(fù)調(diào)控作用，因此，T細(xì)胞亞群的數(shù)目和比值能夠很好地評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能狀態(tài)[21]。白藜蘆醇對(duì)于子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠的干預(yù)，能夠顯著增加血中CD4+T細(xì)胞亞群比例，降低CD8+T細(xì)胞亞群比例，從而提高CD4+/CD8+比值。TNF-α、IL-2和IL-6等細(xì)胞因子是機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和抗癌作用的主要物質(zhì)[22]。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇的干預(yù)還能夠明顯增加荷瘤裸鼠血清中TNF-α、IFN-γ及IL-2等細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步激活機(jī)體免疫功能。因此，白藜蘆醇可通過增加TNF-α、IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，刺激T細(xì)胞的活化，進(jìn)而發(fā)揮增強(qiáng)免疫、抗腫瘤的作用。

Toll樣受體作為天然免疫模式識(shí)別受體，主要存在于免疫細(xì)胞表面，參與機(jī)體的天然免疫和適應(yīng)性免疫過程，多數(shù)單體中藥成分的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用均與TLRs信號(hào)通路有關(guān)[23]。MyD88作為TLRs信號(hào)通路的接頭分子，活化后可激活NF-κB，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫因子的分泌，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖活化[24]。白藜蘆醇對(duì)于子宮內(nèi)膜癌荷瘤祼鼠的干預(yù)，能夠顯著增加脾臟中TLR4、MyD88及NF-κB p65的表達(dá)，而陽性藥順鉑對(duì)荷瘤裸鼠脾臟中TLR4、MyD88及NF-κB p65的表達(dá)無顯著影響，表明白藜蘆醇能夠激活脾臟TLR4/MyD88信號(hào)通路，又進(jìn)一步說明白藜蘆醇具有的促免疫作用可能與激活TLR4/MyD88信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，白藜蘆醇能夠抑制子宮內(nèi)膜癌荷瘤祼鼠腫瘤的生長，其作用機(jī)制可能與激活脾臟TLR4/MyD88信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能有關(guān)。