藤茶總黃酮對小鼠肝纖維化的改善作用

李木松，王利兵，李雯

（1.保定市人民醫院肝五科，河北保定 071000；2.唐山市工人醫院肝膽外科，河北保定 071000；3.保定市人民醫院藥劑科，河北保定 071000）

肝纖維化是多種病因及慢性刺激所致的肝臟疾病共有的肝內結締組織異常增生，具有可逆性，早期確診并采取抗纖維化治療可能逆轉該病變過程，反之則可能發展為肝硬化或肝細胞癌，轉變為不可逆性過程[1]。目前，抗肝纖維化的治療以抑制炎癥或脂質過氧化、肝星狀細胞的增生活化，及促進膠原降解為主。西醫學對肝纖維化治療研究較早，但其治療通常針對抗病毒、抑制自身免疫、改善膽汁淤積等肝細胞損傷誘因，難以從該病復雜的病理機制入手獲取整體治療效果[2]。因此，積極探求更為有效的肝纖維化治療方法具有重要的研究意義。藤茶總黃酮（Tengeha flavonoids，TF）提取自葡萄科顯齒蛇葡萄莖葉，具有抑菌消炎、降血脂、抗氧化、降血糖、保肝護肝等藥理作用[3]。本課題組前期實驗結果表明，TF可改善肝纖維化小鼠病情，但其對該病的肝保護作用及可能的機制尚不明確，因此，本研究通過建立肝纖維化小鼠模型，探討TF對其肝保護作用的機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物45只SPF級雄性ICR小鼠，5周齡，體質量（20±2）g，購自北京維泰瑞技術服務發展有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0013。實驗單位：河北智同生物制藥股份有限公司。常規飼養于籠中，自由攝食、飲水，維持室溫22～24℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物、試劑與儀器藤茶總黃酮（TF，純度≥98%，西安欣祿生物科技有限公司生產，批號：XL180614）。尼日菌素鈉鹽（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：28643-80-3）；花生油（山東魯花集團）；谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）檢測試劑盒，白細胞介素18（IL-18）、白細胞介素1β（IL-1β）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海瑞番生物科技有限公司）；兔抗鼠α-平滑肌蛋白（α-SAM）、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、Caspase-1等一抗（美國Santa cruz公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（北京中杉金橋生物技術有限公司）。CX23光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；UniCel DxC 800全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter有限公司）；Synergy H4全功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Gene GENIUS凝膠成像系統（英國Syngene公司）。

1.3 分組與模型建立從45只小鼠中隨機抽取8只設為正常組，其余37只小鼠隨機分為肝纖維化組（13只）、TF組（12只）、TF＋激活劑組（12只），建立肝纖維化模型。造模方法[4]：CCl4與花生油等體積配制成CCl4花生油溶液，給予小鼠背部皮下注射，2次/周，共12周。首次皮下注射CCl4花生油溶液0.5 mL/100 g，之后注射劑量為0.3 mL/100 g。正常組同法、同量注射花生油。造模結束后，觀察小鼠精神狀態、活動量、飲食量等一般狀態，處死后采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肝臟病理變化，如觀察到有增生性膠原纖維、肝小葉結構被破壞則判斷建模成功。肝纖維化組、TF組、TF＋激活劑組各有5只、4只、4只因未觀察到上述肝臟病理變化而建模失敗，將其數據剔除，最終肝纖維化組、TF組、TF＋激活劑組每組均納入8只小鼠。

1.4 干預方法成功造模后次日開始干預。根據前期實驗確定TF、尼日菌素鈉鹽適用于肝纖維化小鼠的劑量。TF組給予300 mg/kg TF灌胃，1次/d；TF＋激活劑組給予300 mg/kg TF、5 mg/kg尼日菌素鈉鹽灌胃，1次/d；正常組、肝纖維化組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d。連續干預10周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 取材末次干預后4 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取腹主動脈血5 mL，離心后冷凍保存。血液采集完畢，頸椎脫臼處死小鼠，迅速解剖、分離肝臟，清除周圍脂肪，生理鹽水漂洗至肝臟變色以盡可能除去殘留紅細胞，切取4 mm左右厚度組織塊用40 g/L多聚甲醛固定用于免疫組織化學染色及馬松（Masson）染色，其余組織迅速保存于液氮中用于ELISA檢測及蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測。

1.5.2 檢測血清肝功能指標應用全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT水平，嚴格按照小鼠AST、ALT試劑盒說明書要求設計檢測步驟。

1.5.3 檢測肝組織炎癥因子指標含量取肝組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿后，采用ELISA法檢測肝組織IL-18、IL-1β含量，具體操作步驟按照IL-18、IL-1β試劑盒說明書進行，應用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度（OD）值。以標準品濃度和OD值繪制標準曲線，根據標準曲線計算IL-18、IL-1β含量。

1.5.4 免疫組織化學染色法檢測肝組織α-SAM表達取40 g/L多聚甲醛中固定的肝臟組織，制石蠟切片，切片厚度5μm；浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中脫蠟10 min；3%H2O2溶液使內源性酶失活，常溫孵育25 min；微波修復抗原，冷卻后以體積分數5%胎牛血清封閉；加入兔抗鼠α-SAM一抗（1∶200稀釋），4℃孵育過夜；PBS溶液搖床洗滌切片，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶800稀釋），常溫孵育60 min；PBS洗滌，滴加3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）顯色液，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。光學顯微鏡下隨機選取5個不相鄰切片觀察染色結果，應用ImageJ 2x軟件掃描，α-SAM表達水平以陽性染色面積百分比表示。

1.5.5 Masson染色法觀察肝纖維化病變石蠟切片常規脫蠟后，浸入蘇木精染液染色10 min，蒸餾水漂洗干凈染液；1%鹽酸酒精分化液分化5 s，蒸餾水充分水洗；Masson染液染色8 min，蒸餾水沖洗干凈染液；0.2%冰醋酸溶液、1%磷鉬酸溶液分別浸洗3 min、5 min；苯胺藍液復染5 min；0.2%冰醋酸溶液處理2 min；常規乙醇、二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察肝纖維化病變。

1.5.6 Western Blot法檢測肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達取肝組織，眼科剪充分剪碎，PBS勻漿后移至離心管，放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒定量；取50μg樣本按比例與上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，離心取上清，電泳后濕轉至硝酸纖維素膜上；50 g/L脫脂牛奶封閉2 h；加入兔抗小鼠NLRP3、ASC、Caspase-1一抗，4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h；TBST洗膜，電化學發光（ECL）法顯色、曝光，應用凝膠成像系統進行分析。結果以待測目的蛋白/內參GAPDH灰度值表示目的蛋白相對表達量。重復3次取均值。

1.6 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況及肝臟大體解剖比較正常組小鼠皮毛光滑，反應敏捷，性情溫和，食欲正常，體質量穩定增長，解剖后可觀察到肝臟表面細膩、光滑，體積正常；肝纖維化組小鼠皮毛蓬亂、無光澤，動作遲緩，易暴躁、恐慌，體質量明顯降低，解剖后可觀察到肝臟表面粗糙，與周圍組織黏連，體積增大；TF組、TF＋激活劑組小鼠皮毛、反應、性情、體質量等狀態較肝纖維化組改善，肝表面顆粒感與增大程度較肝纖維化組減輕，而TF組整體效果優于TF＋激活劑組。各組小鼠肝臟大體形態見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟大體變化比較Figure 1 Comparison of macroscopical features of liver in mice of various groups

2.2 各組小鼠血清ALT、AST水平比較表1結果顯示：與正常組比較，肝纖維化組血清ALT、AST水平升高（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，TF組、TF＋激活劑組血清ALT、AST水平降低（P＜0.05）；與TF組比較，TF＋激活劑組血清ALT、AST水平升高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平比較Table 1 Comparison of serum ALT and AST levels in mice of various groups （±s，U·L-1）

表1 各組小鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平比較Table 1 Comparison of serum ALT and AST levels in mice of various groups （±s，U·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與肝纖維化組比較；③P＜0.05，與TF組比較

AST 150.29±22.57 414.36±58.80①253.62±31.14①②202.24±25.01①②③75.071＜0.001組別正常組肝纖維化組TF組TF＋激活劑組F值P值鼠數/只8 8 8 8 ALT 49.56±5.27 286.94±25.50①132.26±19.87①②196.30±22.31①②③205.383＜0.001

2.3 各組小鼠肝組織IL-18、IL-1β含量比較表2結果顯示：與正常組比較，肝纖維化組肝組織IL-18、IL-1β含量升高（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，TF組、TF＋激活劑組肝組織IL-18、IL-1β含量降低（P＜0.05）；與TF組比較，TF＋激活劑組肝組織IL-18、IL-1β含量升高（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肝組織IL-18、IL-1β含量比較Table 2 Comparison of IL-18 and IL-1βcontents in mice of various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各組小鼠肝組織IL-18、IL-1β含量比較Table 2 Comparison of IL-18 and IL-1βcontents in mice of various groups （±s，pg·mL-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與肝纖維化組比較；③P＜0.05，與TF組比較

IL-1β 68.57±9.01 545.59±91.23①231.63±36.20①②320.68±49.01①②③104.492＜0.001組別正常組肝纖維化組TF組TF＋激活劑組F值P值鼠數/只8888 IL-18 135.71±16.93 426.51±58.39①259.23±30.16①②334.66±42.21①②③75.780＜0.001

2.4 各組小鼠肝組織α-SAM表達比較圖2結果顯示，正常組、肝纖維化組、TF組、TF＋激活劑組α-SAM陽性染色面積百分比分別為（0.62±0.05）%、（4.03±0.67）%、（1.94±0.35）%、（2.71±0.62）%。與正常組比較，肝纖維化組肝組織α-SAM陽性染色面積百分比升高（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，TF組、TF＋激活劑組肝組織α-SAM陽性染色面積百分比降低（P＜0.05）；與TF組比較，TF＋激活劑組肝組織α-SAM陽性染色面積百分比升高（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠肝組織α-SAM表達比較（免疫組織化學染色法，×200，標尺50μm）Figure 2 Comparison ofα-SAM expression in mouse liver tissue of various groups（by immunohistochemical staining，×200，scale 50μm）

2.5 各組小鼠肝組織纖維化情況比較圖3結果顯示：正常組肝臟結構正常，未觀察到明顯纖維組織增生及肝小葉形成；肝纖維化組可觀察到大量增生性膠原纖維，肝小葉結構被嚴重破壞；TF組、TF＋激活劑組肝臟膠原纖維沉積、纖維性增生及假小葉形成較肝纖維化組有所減少，纖維間隔較肝纖維化組縮小，而TF組效果優于TF＋激活劑組。

圖3 各組小鼠肝臟組織纖維化情況比較（Masson染色，×200，標尺50μm）Figure 3 Comparison of liver fibrosis in mice of various groups（by Masson staining，×200，scale 50μm）

2.6 各組小鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達比較圖4、表3結果顯示：與正常組比較，肝纖維化組肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，TF組、TF＋激活劑組肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與TF組比較，TF＋激活劑組肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的Western Blot電泳條帶Figure 4 Western Blot bands of NLRP3，ASC and Caspase-1 proteins in mouse liver tissues of various groups

表3 各組小鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達比較Table 3 Comparison of protein expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in mouse liver tissues of various groups （±s）

表3 各組小鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達比較Table 3 Comparison of protein expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in mouse liver tissues of various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與肝纖維化組比較；③P＜0.05，與TF組比較

組別正常組肝纖維化組TF組TF＋激活劑組F值P值Caspase-1相對表達量0.05±0.01 0.66±0.08①0.13±0.02①②0.26±0.04①②③276.204＜0.001鼠數/只8888 NLRP3相對表達量0.09±0.01 0.53±0.06①0.24±0.03①②0.36±0.05①②③156.394＜0.001 ASC相對表達量0.18±0.02 0.64±0.07①0.29±0.03①②0.40±0.05①②③142.314＜0.001

3 討論

肝纖維化是一種病程較長的進展性疾病，以肝實質修復損傷，細胞外基質合成、分解失衡，間質成分持續被激活，纖維結締組織過度沉積等為主要病理變化[5]。遏制并逆轉肝纖維化過程，對于臨床治療慢性肝病、預防肝硬化具有關鍵作用。隨著對中醫學研究的不斷深入，多種中藥如藤茶具有較為滿意的肝纖維化防治效果。藤茶總黃酮（TF）是藤茶中含量最多的化合物，被認為是極具肝臟疾病治療潛力的活性成分[6]。藤茶中總黃酮含量約44.0%，以蛇葡萄素、楊梅素、二氫楊梅素等為代表，既往研究[7]證實，其除抗微生物、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等常規作用外，還具有降糖、解酒、抗皮膚老化、保肝、保護心血管與神經系統等藥理活性。

肝星狀細胞是細胞外基質的主要來源，其激活是肝纖維化發生的核心環節，該細胞具有促炎、促纖維化及可收縮性，可分泌細胞外基質成分如α-SAM。α-SAM表達增加是肝星狀細胞激活的主要標志物，與肝纖維化進程密切相關[8]。本研究結果顯示，TF組血清ALT、AST水平，肝組織IL-18、IL-1β含量及α-SAM陽性染色面積百分比均低于肝纖維化組，且Masson染色結果顯示TF組肝臟膠原纖維沉積、纖維性增生及假小葉形成有所減少，纖維間隔縮小，提示TF可保護肝纖維化小鼠肝功能，減輕炎癥反應及肝纖維化程度。

Nod樣受體是細胞中重要的模式識別受體，NLRP3是主要的Nod樣受體類型，被激活后與Caspase-1、ASC組成炎癥小體[9]。炎癥小體屬于一種可激活炎癥反應的多蛋白復合物，在先天性免疫及炎癥相關疾病進程中扮演著重要角色。NLRP3炎性小體是先天免疫系統的重要組成部分，可響應微生物感染與細胞損傷，具有抗微生物及免疫調節作用，通過介導Caspase-1激活和促炎細胞因子IL-1β/IL-18的分泌，導致細胞焦亡[10]。近年來研究[11-12]發現，炎癥反應是肝纖維化及肝損傷的常見病因，而NLRP3炎性小體的激活是其中關鍵的分子機制。NLRP3炎性小體存在于樹突狀細胞、中性粒細胞、枯否細胞等內源性免疫細胞以及肝星狀細胞、肌成纖維細胞、肝細胞等非免疫細胞中，當被致病因素刺激時，肝臟細胞中NLRP3炎性小體活化，進而誘發肝纖維化。因此推測，開發NLRP3炎性小體抑制劑或許可阻斷肝纖維化進程，防止病情惡化。尼日菌素鈉鹽是Streptomyces hygroscopicus衍生而來的抗生素，通過充當H+、K+、Pb2+的離子載體發揮生物學作用，可激活NLRP3炎性小體以誘導炎癥及免疫刺激過程[13]。本研究采用尼日菌素鈉鹽干預后發現，其使用可在一定程度上減弱TF對肝纖維化的治療作用，故推測TF可能是通過抑制NLRP3炎癥小體通路發揮保肝作用。

綜上所述，TF可改善肝纖維化小鼠肝功能，減輕炎癥反應及肝纖維化程度，其可能通過抑制NLRP3炎癥小體通路來實現。