補氣通絡膠囊調控孕甾烷X受體活性成分的篩選及液相色譜-串聯質譜同時測定研究

黃楚燕，楊棣華，陳彭龍，梁宏宇，李慶國，任輝，4

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，廣東廣州 510405；3.廣東省第二中醫院心血管科，廣東廣州 510095；4.廣州中醫藥大學第一附屬醫院骨科，廣東廣州 510405）

肌骨損傷在臨床上除使用手術、康復治療外，也可以配合中藥促進機體特別是損傷部位的恢復[1-4]。補氣通絡膠囊為廣州中醫藥大學第一附屬醫院根據臨床驗方——補氣通絡方開發出的專科制劑，具有補氣生肌、活絡止痛的功效，主治神經損傷、氣滯血瘀所致的各種癱軟、疼痛、損傷等病癥，廣泛應用于骨傷、康復、神經外科相關疾病的治療和恢復[5-7]。該藥處方量較大，病患及醫護人員評價較好，有廣闊開發和深入研究前景。但目前補氣通絡膠囊的主要治療機制尚不明確，也未有針對上述功效、機制建立科學、準確、可量化的工藝和質量評價標準，嚴重制約了該制劑的研發和使用。

研究中藥特別是復方中藥的功效機制，通常通過找到與疾病和/或其發生發展機制相關的信號通路、關鍵作用靶標，研究藥物干預下上述通路/靶標及其上下游基因的表達變化，探尋中藥的主要作用機制。孕甾烷X受體（PXR）是廣泛分布于肝、腎等器官中的核受體，具有較強的外源性物質敏感性，因此能夠在機體生理病理變化或藥物干預的情況下，對體內物質、能量代謝、炎癥反應等生物學活動產生顯著的調控作用。同時，PXR是多條糖脂、能量和炎癥遞質代謝的關鍵調控位點，其表達變化能夠調控多種上下游基因的表達，進而影響相關臟器的功能，其為近年來較多受到分子生物學、藥理學相關研究者重視的內源性核受體。該靶標具有明顯的體內能量、營養物質代謝調控能力，能夠促進損傷修復和肌肉再生[8-10]，此與補氣通絡膠囊的功效主治內容基本吻合，故認為PXR可以作為解釋該制劑相關功效的分子生物學基礎。

補氣通絡膠囊由丹參、川芎、當歸、黃芪、紅參、姜黃等藥味組成，其中丹參為君藥，川芎、當歸為臣藥。文獻報道，上述中藥材中有多個化學成分具有促進損傷修復、增強體質和免疫力、促進機體能量生成和物質代謝等方面的功效，可能是補氣通絡膠囊發揮治療作用的物質基礎[11-16]。然而，該制劑藥味較多，各味藥材中含有多種功能、含量、理化性質均有較大差異的化學成分，因此本研究采用UPLC-TOF-MS[17-22]等高分辨率儀器分析方法進行化合物快速鑒別，并根據結果確定候選成分進行PXR調控活性篩選，進而建立含量同時測定方法，以期明確該藥的調控機制和主要活性成分，為研究該制劑的治療功效機制和物質基礎提供科學依據。現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器AB SCIEX TripleTOF 5600+超高效液相色譜-飛行時間質譜（美國AB SCIEX公司）；ABI StepOnePlus PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；Dual-Glo熒光檢測儀（美國PerkinElmer公司）；Aquity-UPLC-X-class-Xevo-TQ-MS超高效液相色譜-質譜聯用儀（美國Waters公司）；Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；Millipore自動凈水儀。

1.2 藥物、細胞與試劑補氣通絡膠囊（由本院制劑室生產，批號：20190101-20200901）；對照品：丹參酮ⅡA（批號：110766-202022）、丹酚酸B（批號：111562-201917）、歐當歸內酯A（批號：111826-201806）、藁本內酯（批號：111737-201910）、阿魏酸（批號：110773-201915）、川芎嗪（批號：100845-201603）、黃芪甲苷（批號：110781-202118）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201907）、毛蕊花糖苷（批號：111530-201914）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202028）、人參皂苷Rb3（批號：111686-202005）、人參皂苷Rg1（批號：110703-202034）、人參皂苷Rd（批號：111818-201603）、人參皂苷Re（批號：110754-202028）、姜黃素（批號：110823-201706），由中國食品藥品檢定研究院提供。

骨骼肌細胞，由美國ATCC公司提供。SuperScriptTMVILOTMcDNA逆轉錄、TaqMan基因表達試劑盒（美國Applied Biosystems公司）；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純級，德國Merck公司）；超純水由Milli-Q制備。

2 方法

2.1 液相色譜及質譜條件

2.1.1 液相色譜條件色譜柱采用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱溫為35℃；流速0.3 mL/min；流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～3 min，5%～60%B；3～12 min，60%～80%B；12～14 min，80%～90%B；14～15 min，90%～100%B；15～18 min，100%B；18～22 min，100%～5%B。

2.1.2 質譜條件正負離子同時掃描，質荷比范圍為50～1 500 Da；噴霧電壓為4 500 V；汽化溫度500℃；碰撞能35 eV；解離電壓100 V；離子源氣壓55 psi；氣簾壓力35 psi；其余設定均為儀器預設值。所得圖譜和數據導入AB Sciex Analyst Software 1.6軟件中進行分析，圖譜見圖1，各組分離子對信息見表1。根據所得結果，選擇已知且信號強度適宜的成分作為活性候選。

表1 補氣通絡膠囊各成分LC-MS參數Table 1 LC-MS parameters of each component of Buqi Tongluo Capsules

圖1 補氣通絡膠囊UPLC-TOF-MS圖譜Figure 1 UPLC-TOF-MS chromatogram of Buqi Tongluo Capsules

2.2 候選成分PXR調控活性研究使用LanthaScreen（TR）-FRET PXR試劑盒（#PV4839，購自美國Invitrogen公司），按說明書方法進行細胞轉染：吸取20μL上述試液，轉移至含PXR配體結合域、熒光標記PXR激動劑和GST抗體，IMP（6.25～25μmol/L），SR12813（10μmol/L）或PCN（10μmol/L）的96孔板中，混勻后室溫（25℃）反應20 min。向上述溶液中加入各化合物單體溶液（25μg/mL，溶劑為DMSO）10μL，孵育后使用TRIzol試劑盒提取總RNA，再使用SuperScriptTMVILOTMcDNA逆轉錄試劑盒處理，所得溶液測定熒光值。根據結果選出與參比組（加DMSO）存在明顯差異者，繼續考察不同濃度（12.5、50μg/mL）各成分的PXR調控活性。結果顯示，加入丹參酮ⅡA、歐當歸內酯A、藁本內酯、川芎嗪、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、姜黃素等單體溶液的組別與參比組比較PXR活性變化明顯，且上述活性與給藥劑量存在顯著相關性，因此，可以將這些成分列為補氣通絡膠囊的PXR調控活性成分。結果見圖2。

圖2 補氣通絡膠囊各化學成分對PXR表達的影響Figure 2 Effects of chemical components of Buqi Tongluo Capsules on PXR expression

2.3 活性成分含量測定方法質譜檢測條件：使用電噴霧離子源（ESI源），正負離子同時掃描，毛細管溫度設定為120℃，吹掃氣（氮氣）流速設置為50 L/h，毛細管電壓設置為3 kV，碰撞氣（氬氣）流速0.16 mL/min，汽化流速650 L/h，汽化溫度350℃，掃描使用多反應監測模式（MRM），監測離子對見表1。碰撞能量均為正離子35 eV，負離子30 eV。色譜條件：Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5%～5%B；0.5～1.0 min，5%～90%B；1.0～2.5 min，90%～90%B；2.5～3.0 min，90%～5%B；流速0.3 mL/min，柱溫30℃，進樣量1μL。混合對照品和供試品UPLC-MS圖譜見圖3。由于人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd在供試品中未測到，因此，方法學考察中未將此2個成分列入指標。

圖3 補氣通絡膠囊各成分對照品和供試品UPLC-MS圖譜Figure 3 UPLC-MS chromatogram of reference substance and test substance of each component in Buqi Tongluo Capsules

2.4 多批次樣品含量測定取補氣活血膠囊內容物，精密稱取約0.2 g，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇（每mL含地西泮100 ng）至刻度，密塞；超聲30 min后，取出，放冷，加前述50%甲醇定容至刻度；精密吸取所得溶液0.1 mL，轉移至10 mL量瓶中，加前述50%甲醇定容至刻度，所得溶液使用0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。另取丹參酮ⅡA、歐當歸內酯A、藁本內酯、川芎嗪、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、姜黃素對照品，分別精密稱取5 mg，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇（每mL含地西泮100 ng）溶解并定容至刻度，即得上述成分濃度均為500μg/mL的混合對照品溶液。分別吸取上述溶液，按“2.3”項下方法檢測，記錄供試品和對照品溶液中各成分、內標峰面積，計算供試品溶液中各成分的含量。

2.5 含量測定方法學考察

2.5.1 標準曲線和線性關系取“2.4”項下配制的對照品溶液，加含內標的甲醇溶液（每mL含地西泮100 ng，下同）稀釋，配制成濃度為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL的溶液，所得溶液使用“2.3”項下方法測定，記錄各目標成分和內標峰面積，計算上述成分與內標的峰面積比。以峰面積比為橫坐標x，對應化合物濃度為縱坐標y，代入Excel進行線性回歸。各待測組分的回歸方程及相關系數結果見表2。結果表明，方法在5～1 000 ng/mL范圍內對補氣通絡膠囊各組分含量測定準確度良好。

表2 補氣通絡膠囊各待測組分的回歸方程及相關系數Table 2 Regression equation and correlation coefficient of each undetermined group in Buqi Tongluo Capsules

2.5.2 精密度考察取供試品溶液，使用“2.3”項下方法測定，連續測定6次，記錄各目標成分和內標峰面積，計算上述成分與內標的峰面積比，計算峰面積比的相對標準偏差（RSD）。結果顯示，各組分峰面積比的RSD為0.40%～2.90%（備注：因供試品溶液中未測到人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd，故精密度及后續考察中未列入上述2個成分），經檢索2020年版《中國藥典》，結果符合相關規定，表明檢測方法精密度良好。

2.5.3 重復性考察取補氣通絡膠囊內容物，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，共平行制備6份，再按“2.3”項下方法測定，計算上述成分與內標的峰面積比，計算各組分的含量和含量的RSD。結果顯示，各組分含量的RSD為0.40%～2.63%，經檢索2020年版《中國藥典》，結果符合相關規定，表明檢測方法重復性良好。

2.5.4 穩定性考察取供試品溶液，放置于自動進樣器中，并于放入后0、2、4、6、8、12 h按“2.3”項下方法測定，計算上述成分與內標的峰面積比，計算各組分的含量和含量的RSD。結果顯示，各組分含量的RSD為0.29%～2.25%，經檢索2020年版《中國藥典》，結果符合相關規定，表明檢測供試品在12 h內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收試驗取補氣通絡膠囊內容物，精密稱取約0.1 g，置于25 mL量瓶中，精密加入對照品單體溶液適量（濃度見表3），其余操作按“2.4”項下方法制備供試品溶液，所得溶液按“2.3”項下方法測定，計算上述成分與內標的峰面積比，計算各組分的含量、回收率和回收率的RSD。結果顯示，各組分回收率在98.82%～103.22%之間，RSD在1.42%～4.71%之間，經檢索2020年版《中國藥典》，結果符合相關規定，表明檢測方法準確度良好。

表3 加樣回收率測定結果Table 3 Determination results of recovery rate （n=3）

2.6 多批次補氣通絡膠囊含量測定結果及各成分PXR調控活性評價取補氣通絡膠囊內容物，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定，計算上述成分與內標的峰面積比，計算各組分的含量，結果見表4。將上述結果換算成給藥濃度（即根據大鼠藥效學試驗劑量換算，設定1粒含內容物0.2 g的膠囊溶于25 mL水中），所有PXR激動成分濃度在13.009 8～72.333 6μg/mL范圍內，與“2.2”項下考察濃度基本相似；所有PXR抑制成分（人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd未測到）濃度在5.203 3～26.976 7μg/mL范圍內。上述結果表明，補氣通絡膠囊中各PXR調控活性成分的含量適宜，PXR激動活性占主流，能夠發揮相關功效活性。

表4 補氣通絡膠囊10批供試品含量測定結果（已換算為給藥劑量）Table 4 Content determination results of 10 batches of Buqi Tongluo Capsules tested products[化合物含量/（μg·mL-1）]

（續表3）

3 討論

本研究UPLC-TOF-MS測定完成后，經AB Sciex Analyst Software 1.6軟件比對檢索，發現補氣通絡膠囊中含有多種成分，主要涉及黃酮、皂苷、香豆素、萜類等。其中，多個成分雖在檢測中具有較高的信號強度，但這些成分的化學結構目前尚未明確，且經檢索中國食品藥品檢定研究院等對照品供應商網站，并未找到這些化合物的市售對照品，因此，本研究未將它們列入候選成分進行下一步考察。為更好、廣泛地獲取補氣通絡膠囊的成分信息，建議在后續研究中，對上述未知成分進行更加精細的提取、分離、純化，并采用核磁共振等技術獲取上述成分的結構信息，為深入研究該制劑的治療功效和藥效物質提供科學依據。

研究表明，PXR被激活呈高表達時，會刺激AMPK、ERK等下游靶標，增強其活性，進而加速細胞的生成和能量、代謝物的轉運。同時，PXR作為核受體，也能夠對機體ATP合成以及靶器官血流量起到顯著的調控作用。在補氣通絡膠囊中PXR激動活性成分的作用下，機體基礎代謝率升高，細胞分裂、損傷組織修復所需的氨基酸、蛋白、ATP等內源性成分加速向損傷部位轉運和富集，加速了這些部位的修復和組織再生。

目前為止，尚未見到補氣通絡膠囊方中各藥味的PXR調控活性研究。其原因主要是，PXR的研究報道集中于糖脂、膽固醇代謝及與之相關的炎癥、氧化應激、肝損傷等領域[23-24]。研究表明，三七皂苷對藥物代謝酶CYP3A具有抑制作用[25]。三七所含化學成分與紅參具有一定的相似性，能夠從間接角度證明以PXR為切入點研究補氣通絡膠囊功效機制的科學性。關于復方中藥PXR調控活性的研究，則表明多種黃酮類成分也有較強的PXR調控活性[26]。上述研究成果雖不能作為補氣通絡膠囊中所含成分通過影響PXR表達發揮功效的直接證據，但能夠為同一類型或類似結構成分的活性篩選以及功效機制研究提供方向以及間接證據，即通過比較功效相似的藥味、成分或復方制劑，找到研究其機制和藥效物質的切入點，進而明確化學成分與相關靶標間的作用。

本研究的PXR調控活性考察結果顯示，除阿魏酸外，其余所有在飛行時間質譜中鑒定出并被列為候選的成分，均能夠顯著調控PXR表達。但是，這些成分對PXR的影響呈兩極分化的趨勢，即部分成分具有明顯的PXR表達抑制活性，另一部分成分則具有明顯的PXR激動活性。具體而言，皂苷和部分黃酮類成分，如人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、姜黃素等成分能夠顯著抑制PXR表達，而丹參酮ⅡA、歐當歸內酯A、藁本內酯、川芎嗪、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷等成分則能夠明顯刺激PXR表達。研究表明，PXR低表達時，生物體內脂質、膽固醇等物質的含量顯著下降，其原料、前體物質，如脂肪酸、膽汁酸則呈現明顯的分解、代謝、外排等情況，膽固醇代謝相關上下游基因的活性產生明顯改變，機體能量代謝也呈上升趨勢。反之，PXR高表達時，能量消耗減少，脂質、膽汁酸合成量增加，同時，體內炎癥因子水平和氧化應激反應明顯下降，炎癥反應受到抑制，損傷肝組織一定程度得到恢復。因此，藥物特別是復方中藥發揮PXR調控作用時，其具體功效可能會因為該藥所含化學成分的這種相抵觸的活性而受到影響。換言之，為更好地發揮目標功效，在設定藥物工藝和質量評價指標時，除應設定具有目標活性的成分的含量下限外，還需對具有無關甚至相反功效的成分的含量上限進行控制。

本研究的含量測定結果顯示，絕大部分批次的補氣通絡膠囊中對PXR起激動活性的成分含量均大于25μg/mL，表明這些成分具備足夠發揮功效活性所需的體內藥量的可能性；而PXR抑制活性成分中，只有姜黃素基本達到活性測試的最低濃度，表明大多數抑制活性成分不具備達到發揮其功效所需的藥物濃度。綜合兩方面成分含量測定結果，可知補氣通絡膠囊所含化學成分主要發揮PXR激動活性，抑制活性因相關成分含量較低而不明顯表現，且無法與前者形成對沖。PXR激動活性成分主要來自于丹參、川芎、當歸和黃芪，抑制活性成分則主要來自紅參、姜黃。含量測定結果表明，前4種藥味中各活性成分含量較高，而后4種藥味中活性成分含量較低，這可能是由于補氣通絡膠囊為全方水提，部分成分可能未被有效提取或在提取過程中水解。但是，上述結果并不能表明紅參、姜黃對療效無貢獻或存在破壞性。這是因為紅參具有增強免疫力、補氣血的功效，而姜黃的活血化瘀功效也較強。上述2個藥味對補氣通絡膠囊藥效的貢獻機制及其具體藥效成分，有待進一步的研究。