蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎的網絡藥理學機制與細胞驗證

王象鵬，羅孟雄，畢亦飛，謝文鵬，王寶安，畢榮修

（1.山東中醫藥大學，山東濟南 250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東濟南 250014；3.山東中醫藥大學附屬眼科醫院，山東濟南 250002；4.山東商業職業技術學院，山東濟南 250103）

骨性關節炎（osteoarthritis）是以關節軟骨退變、關節滑膜炎性病變及關節疼痛為主要特征的中老年常見退行性骨關節疾病。流行病學研究[1-2]顯示，我國骨性關節炎患者40歲以上約占30%，65歲以上占比高達70%，主要臨床表現為關節疼痛，X線片顯示關節形變，同時，隨著患者年齡的增加癥狀也會增加，嚴重影響患者的正常生活。骨性關節炎的發病機制尚未完全明確，多數學者認為與性別、年齡、外傷、機體炎癥、遺傳及生物力學等因素共同作用導致關節軟骨細胞、細胞外基質以及關節軟骨下骨發生降解及偶聯失衡有關[3]。目前，治療骨性關節炎的方法主要包括飲食調節、運動調控、相關藥物防治以及手術介入等，臨床治療骨性關節炎的藥物主要以西藥對癥治療為主，雖然具有見效快的特點，但并不能有效阻止骨性關節炎的發展，并且存在副作用大、病患耐受性差、靶點單一等缺點[4]。而中醫藥治療因“簡便效廉”的特性，治療各類骨性關節炎具有一定的優勢。

骨性關節炎歸屬于中醫學“骨痹”“痹證”的范疇[9]，與肝、腎、脾三臟關系密切，主要因肝腎虧虛、氣血不足致筋脈失養，“風”“寒”“濕”“瘀”致筋脈不通等引起。蒼膝通痹膠囊是山東中醫藥大學附屬醫院骨科積累多年臨床經驗與中醫經典總結而成的特色中醫復方藥物，已獲山東省藥監局批準（批號：魯藥制字Z20130043），其由獨活、威靈仙、桑寄生、蒼術、萆薢、雞血藤、川牛膝、骨碎補及川續斷等9味中藥組成，諸藥合用，共同發揮補益肝腎氣血、祛散風寒濕邪的功效。前期研究表明，蒼膝通痹膠囊對骨性關節炎具有良好的臨床效果，但對其組方的科學依據、各類藥物產生的藥效物質基礎和分子機制尚不明確。因此，本研究采用網絡藥理學與分子對接技術探討蒼膝通痹膠囊對骨性關節炎關節軟骨的保護作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學預測

1.1.1 基于化合物群單體功能比較研究分析通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）數據庫尋找本方中獨活、威靈仙、桑寄生、蒼術、萆薢、雞血藤、川牛膝、骨碎補及川續斷等9味中藥的化合物成分。為了闡明中藥之間的化學、藥理學上的空間差異，采用藥物口服生物利用度（OB）、藥物相似性（DL）、化合物相對分子質量（MW）、H-鍵配位電子供體數目（nHdon）、H-鍵配位電子受體數目（nHacc）、脂-水分配系數（AlogP）等[5]6項藥理學核心參數對藥物化合物進行評價，對其數據進行分布分析，并對所在相應區間進行T檢驗。

1.1.2 蒼膝通痹膠囊中藥物活性成分的篩選及治療靶點檢索TCMSP數據庫獲得蒼膝通痹膠囊化學成分的數據，依據藥物動力學[6]進行篩選，其中必要條件為OB≥30%、DL≥0.18[7-8]。

1.1.3 蒼膝通痹膠囊活性成分-靶點網絡的構建檢索TCMSP數據庫查找蒼膝通痹膠囊化學成分相關的蛋白靶點，同時運用Uniprot數據庫查找基因名稱。將蒼膝通痹膠囊化學成分及其對應的作用靶點基因導入到Cytoscape 3.6.1軟件，構建蒼膝通痹膠囊活性成分與靶點的生物信息網絡。

1.1.4 已知骨性關節炎相關疾病靶點的檢索以“osteoarthritis”作為關鍵詞，檢索Therapeutic Target Database（TTD）、Drug Bank、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、Genetic Association Database（GAD）和Pharm GKB等5個數據庫中已知的骨性關節炎靶點，刪除重復所獲得的靶點，即為骨性關節炎發病過程已知的靶點。

1.1.5 藥物成分與靶點的構建將“1.1.3”項中挖掘的藥物靶點與“1.1.4”項中挖掘的疾病靶點合并，去除重復項，合并上述靶點并篩選共同靶點。應用Cytoscape軟件構建構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。

1.1.6 分子對接采用分子對接技術驗證蒼膝通痹膠囊的有效活性成分與關鍵靶點分子對接的可靠性。檢索PDB數據庫獲取所需要的化合物蛋白結構，運用AutoDock Vina軟件，將蒼膝通痹膠囊的有效活性成分與靶點的空間腔相對接，以結合的最佳構象進行分析。

1.1.7 靶點的基因本體論（GO）分析及信號通路的京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析應用Clue GO、KEGG分析插件富集分析“1.1.5”項數據挖掘所獲得的關鍵靶點及通路。其中，類型相同的采取相同顏色在圖中表示，其對接相關顯著性用節點的大小進行表示，信號通路的顯著性越高則在網絡中的相關節點越大，反映該通路具有十分重要的作用及相關性。

1.2 體外細胞實驗

1.2.1 試劑與儀器DMEM完全培養基[中科邁晨（北京）科技有限公司]；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；大鼠白細胞介素1β（IL-1β）細胞因子凍干粉（美國R&D Systems公司）；IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（聯科生物科技有限公司）。SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇凈安泰公司）；NanoDrop2000型超微量分光光度計（美國Thermo公司）；Axiovert 40型顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2.2 藥物及制備蒼膝通痹膠囊原方由獨活15 g、威靈仙12 g、蒼術12 g、萆薢15 g、雞血藤15 g、桑寄生12 g、川牛膝15 g、骨碎補12 g、川續斷12 g組成，以上中藥材均購于山東中醫藥大學附屬醫院。將蒼膝通痹膠囊原方組成中的中藥材制作成干粉，使用時，取100 mg，加入到100 mL完全培養基中，用渦旋振蕩器充分溶解，0.22μm無菌濾網過濾，配制成1 mg/mL的母液，然后根據所需蒼膝通痹膠囊的濃度進行稀釋。

1.2.3 軟骨細胞的提取選用1周齡SD雄性大鼠[購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號：SCXK（魯）20140007]，處死，清理毛發，用75%酒精浸泡。取股骨髁部及脛骨平臺部位的關節軟骨，用含有1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的PBS溶液沖洗，將組織剪成碎塊，體積約為1 mm3，再以2.5 g/L胰蛋白酶進行消化，耗時30 min，后采用Ⅱ型膠原酶溶液消化4 h。待細胞密度達到2×105個/mL時，將處理后的細胞接種于25 cm2培養瓶中，置于恒溫培養箱（5%CO2、37℃），最后，通過分離獲得原代細胞。取第2代細胞作為實驗對象，當軟骨細胞生長鋪滿瓶底（達到瓶底面積80%）時進行細胞傳代，比例1∶3。

1.2.4 骨性關節炎細胞模型的制備用20μL滅菌水完全溶解10μg大鼠IL-1β細胞因子凍干粉，再加入80μL含5%海藻糖的稀釋液，稀釋成濃度為100μg/mL的IL-1β溶液。使用時，將每管（10 mL）100μg/mL的IL-1β溶液加入到100 mL完全培養基（取89 mL DMEM培養基，加入1 mL雙抗溶液和10 mL胎牛血清，配制成含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養基，4℃保存備用）中，配成10 ng/mL的IL-1β溶液。將其加入干預正常培養的軟骨細胞，置于培養箱中培養24 h，得到退變軟骨細胞。

1.2.5 甲苯胺藍染色法進行軟骨細胞鑒定軟骨細胞提取完畢后，按5×104個/孔的密度接種于六孔板內。觀察數量超過培養瓶一半面積后，用多聚甲醛固定，然后沖洗5 min，均勻加入甲苯胺藍染液，染色15 min后沖洗，至深藍色消失，最后漂洗至無色進行觀察。

1.2.6 分組將細胞分為空白組、模型組、DMSO組、中藥組、阻滯劑組。除空白組外，其余各組均按“1.2.4”項所示方法用IL-1β構建骨性關節炎細胞模型。空白組、模型組加入完全培養基（DMEM）培養，DMSO組加入含有0.1%DMSO的完全培養基，中藥組加入含有100μg/mL蒼膝通痹膠囊的完全培養基，阻滯劑組為含有50 ng/mL COX-2抑制劑塞來昔布的完全培養基。

1.2.7 ELISA法檢測上清液炎性因子IL-1β、TNF-α水平根據ELISA試劑盒描述方法，用酶標儀測定各指標每孔450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.3 統計方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，所得數據均以均數±標準差（±s）表示。所有數據均采用正態分布檢驗其正態性，對于符合正態分布的多組間數據資料，采用單因素方差分析進行組間比較。進一步兩兩比較，方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊則采用Games-Howell檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 相關藥物單體功能比較結果對9味中藥的4項具有重要意義的藥理學相關描述，即MW、nHdon、nHacc、AlogP，進行統計學比較分析，表1結果顯示：①MW：獨活低于蒼術、萆薢、雞血藤、川牛膝、骨碎補及川續斷，而威靈仙低于萆薢、川牛膝、骨碎補，高于蒼術、雞血藤、川續斷、桑寄生。研究發現獨活、威靈仙相對分子質量均高于桑寄生。②nHdon：川續斷平均值遠高于獨活（P=0.00）、威靈仙（P=0.026）、蒼術（P=0.00）、萆薢（P=0.39）、雞血藤（P=0.001）、桑寄生（P=0.00）、川牛膝（P=0.69）、骨碎補（P=0.96）；③nHacc：川續斷遠高于獨活（P=0.00）、威靈仙（P=0.042）、蒼術（P=0.00）、萆薢（P=0.721）、雞血藤（P=0.001）、桑寄生（P=0.00）、川牛膝（P=0.21）、骨碎補（P=P.58）、川續斷（P=0.38）。④AlogP：蒼術平均AlogP最高，川牛膝最低。此外，各藥物成分之間OB與DL也存在明顯差異。獨活OB平均值最高，與威靈仙、雞血藤、桑寄生近似；相反，獨活DL平均值最低，與威靈仙有顯著性差異（P=0.006）。

表1 蒼膝通痹膠囊各藥物單體功能比較表Table 1 Table of functional comparison of drug monomers in Cangxi Tongbi Capsules

2.2 藥物化合物篩選在TCMSP數據庫共尋找到相關化合物472個，經根據藥理學OB、DL等相關參數閾值要求篩選后，符合上述篩選要求的化合物共有27個。

其中，獨活中5.1%的化學成分同時符合OB及DL兩參數閾值要求，這些化合物被看作是獨活的活性成分并進行下一步的研究，這些化合物包括異歐前胡素（Isoimperatorin）、諾巴托（Nodakenin）、β-谷甾醇（beta-Sitosterol）等；威靈仙中7.14%的化學成分同時符合OB及DL兩參數閾值要求，這些活性成分可進行下一步的研究，包括鄰苯二甲酸二庚酯（Diheptyl phthalate）、豆甾醇（Stigmasterol）等；蒼術同時符合閾值要求的化合物占4.17%，包括3β-乙酰氧基蒼術酮（3β-Acetoxyatractylone）和沃貢寧（Wogonin）；萆薢中符合條件化合物占12.5，為薯蕷皂素（Diosgenin）；雞血藤、桑寄生、川牛膝中符合條件的化合物分別占比為13.43%、4.44%及10.26%，包括甜菜堿（Betavulgarin）、槲皮素（Quercetin）等，骨碎補中符合條件的化合成分占比為15.71%和12.9%，包括圣草酚（Eriodictyol）、沒食子酸（Digallic acid）、谷甾醇（Sitosterol）等。我們對上述符合條件的篩選后化合物進行進一步的數據分析研究。

2.3 疾病靶點和蒼膝通痹膠囊治療靶點映射的結果對GeneCards數據庫進行檢索，共檢索到骨性關節炎相關基因2 644個。采用Venny繪圖軟件對數據進行形象化處理，將蒼膝通痹膠囊的潛在靶點和骨性關節炎相關靶點基因進行映射，取其交集，共獲得186個治療靶點。見圖1。

圖1 蒼膝通痹膠囊與骨性關節炎的靶點映射Figure 1 Targets mapping of Cangxi Tongbi Capsules and osteoarthritis

2.4 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建網絡共有222個靶點，781條邊，27個有效成分及1個疾病名稱；“V”形代表藥物有效成分，方形代表藥物作用的靶點，菱形代表藥物單體，圓形代表疾病名稱。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡Figure 2 Drug-component-target-disease network

在構建的網絡中，度（Degree）表示節點相連接的條數，節點的介數則指不同節點之間最短通路的條數，在研究中發現度值與介數存在密切的相關性，且具有高介數的節點普遍存在向心性。而有一些節點，可能度值低，但具有較高的介數，這說明此類化合物可能存在橋接關系，加強了映射的作用。

2.5 分子對接應用AutoDock Vina軟件對27個候選活性成分與3個骨性關節炎關鍵炎性因子靶點蛋白（TNF-α、IL-1β、MMP-13）進行分子對接，結果如表2、圖3所示。薯蕷皂素（Diosgenin）與TNF-α結合能最強，其占據TNF-α殘基Met122、Gln16、Glu11、lle15組成的空間腔，與IL-1β的Gln16、Glu12及lle15構成的空間腔相連，與MMP-13結合于His187、Ala186、Val219及Glu223組成的空間腔內；TNF-α的THr208、THr206、Pro141、Asn142殘基組成的活性腔與圣草酚（Eriodictyol）相對接，由IL-1β的Pro22、Glu21、Val17、Phe18組成的活性腔很好地將圣草酚（Eriodictyol）包裹；野靛黃素（Pseudobaptigenin）與TNF-α對接于Asn46、Trp28、Asp45等殘基，與IL-1β的結合能是所有化合物對接IL-1β結合能最強的。圖中顯示由Arg67、Asn142、Lys24及Ala23等組成的空間腔可以很好地與其對接，野靛黃素（Pseudobaptigenin）與MMP-13結合能是所有化合物與MMP-13結合能中最強的，占據lle243、Pro242、Val219、Leu184等組成的空間腔。

表2 分子對接結合能統計表Table 2 Statistical table of molecular docking binding energy

圖3 候選活性成分與TNF-α、IL-1β、MMP-13的分子對接Figure 3 Molecular docking of candidate active ingredients with TNF-α，IL-1βand MMP-13

2.6 GO富集分析與KEGG通路富集分析共挖掘出蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎關鍵靶點187個，信號通路40余條。根據基因GO分析、KEGG通路富集分析結果數據表明，其治療的機制應該為對軟骨細胞增殖和凋亡的干預。結果見圖4、圖5。

圖4 蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎關鍵靶點的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of the key targets of Cangxi Tongbi Capsules in the treatment of osteoarthritis

圖5 蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎關鍵靶點的KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis of Cangxi Tongbi Capsules in the treatment of osteoarthritis

2.7 軟骨細胞的鑒定結果圖6可見原代培養的軟骨細胞，并經甲苯胺藍染色鑒定為軟骨細胞。

圖6 軟骨細胞的鑒定結果（甲苯胺藍染色法，×100）Figure 6 Chondrocyte identification results（by toluidine blue staining，×100）

2.8 各組軟骨細胞上清液中炎性因子IL-1β、TNF-α表達水平比較表3結果顯示：與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；DMSO組IL-1β、TNF-α表達水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥組、阻斷劑組IL-1β、TNF-α表達水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表3 各組軟骨細胞上清液中炎性因子IL-1β、TNF-α表達水平比較Table 3 Comparison of expression levels of inflammatory factors IL-1βand TNF-αin chondrocyte supernatant of various groups （±s，pg·mL-1）

表3 各組軟骨細胞上清液中炎性因子IL-1β、TNF-α表達水平比較Table 3 Comparison of expression levels of inflammatory factors IL-1βand TNF-αin chondrocyte supernatant of various groups （±s，pg·mL-1）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組DMSO組中藥組阻斷劑組TNF-α 31.03±0.81 47.53±0.89①46.17±1.03 37.84±0.92②29.21±0.17②IL-1β 44.91±0.42 80.15±1.02①79.33±1.93 63.53±0.25②50.70±0.87②

3 討論

中藥復方又被稱為“方劑”，通常由復雜的多味單體中藥組成，是中醫學治療疾病的主要理念[9]。每個處方并非簡單的中藥雜亂堆積，而是結合中醫中藥理論，遵循中藥配伍規則及相關配對兼容性來治療特定的疾病，其目的是將每味中藥功效最大化，同時依靠相互作用降低本身的毒性。中藥配伍原則基于“君臣佐使”規則，闡釋著方劑中每味中藥的功能以及所在方劑中的整體安排。近些年，對于方劑組成的科學性研究越來越重視，采用現代化藥理技術研究越來越多，計算機建模、拆分等方法越來越受到廣大學者的關注。本研究將系統藥理學引入中藥配伍分析，確定方劑中的活性成分，闡釋各味中藥之間的協同關系及相關疾病治療的作用機制，并通過分子對接技術進一步驗證了本方在骨性關節炎中的治療作用。

本研究結果顯示，蒼膝通痹膠囊方劑組成中，君藥存在2個明顯的特征：藥物化合成分數量最大和藥理學活性最活躍。其中，獨活化合成分最多，并且，根據其濃度獨活的化合成分活性在體內循環系統中也是最活躍的。通過網絡的構建與分析，還可看出獨活與相關靶點關系最為密切，且其中一些化合物還可作為藥物-靶點網絡圖的中心，該中心的使用可能會對骨性關節炎治療產生巨大的影響，這些都為獨活在蒼膝通痹膠囊中發揮巨大作用提供了依據。臣藥威靈仙與獨活存在許多相同的靶點，兩藥重疊靶點數量繁多，這也說明兩藥在藥理學功能上存在相近之處。在臨床中，因獨活性善下行，所以一般單獨使用獨活不能完全地祛除體內風濕，而威靈仙性猛善行全身，通行十二經，上下皆可行，是輔助獨活祛除體內風濕邪氣之要藥，并且通過藥理學分析，二者結合可相應地增加溶解度，有助于提高功效，這些都可以科學地闡明威靈仙為什么可作為臣藥來提高治療能力。佐使藥物在中醫學中通常具有輔助提高、調和藥性的作用，在藥理學中佐使藥一般活性成分相對較少，具有提高藥理作用功能、改善藥代動力學等作用，故認為，蒼膝通痹膠囊中佐使藥物含有淀粉、蛋白質、醇脂類物質，并且相對占比較高，這些可以提升君臣藥物的成分溶解度，提高其吸收作用率，從而達到提高藥理學功能的作用。

本研究應用網絡藥理學數據挖掘技術共挖掘出蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎的關鍵靶點187個，信號通路40余條，基因GO分析、KEGG通路富集分析結果數據表明，其治療的機制應為對軟骨細胞增殖和凋亡的干預。關節軟骨是骨性關節炎發生、發展過程中極易侵犯的部位，而軟骨細胞作為關節軟骨內合成軟骨基質的唯一細胞，在關節軟骨正常結構的保護維持及關節軟骨功能保護方面重要的病理特征[10]。當軟骨細胞受到炎性因子、機械應力等刺激時，會發生細胞內的信號轉導，將信號傳遞給相關轉錄因子，激活其介導的相應生物學效應。軟骨細胞凋亡是骨性關節炎發病過程中重要的病理特征。已有研究表明，炎性因子TNF-α和IL-1β在骨性關節炎發生及發展過程中起到關鍵的作用，在骨性關節炎的實驗動物模型以及患者中均檢測出高表達的TNF-α和IL-1β，二者干預關節軟骨細胞代謝，抑制細胞外基質蛋白的合成，促進分解酶的釋放，使軟骨細胞逐漸遭到破壞[11-12]。IL-1β是重要的炎性介質，在人體關節液中占主要成分，骨性關節炎患者的IL-1β表達與其病情呈正相關；TNF-α可刺激滑膜產生前列腺素E2（PGE2），繼而加重軟骨下骨的吸收，引發關節軟骨的Ⅱ型膠原破壞。骨性關節炎發生時，軟骨組織大量地分泌TNF-α，誘導成纖維增生，形成血管翳，久之造成關節破壞[13]。TNF-α和IL-1β還是上述KEGG分析結果中信號通路的主要上游炎性因子，可激活軟骨細胞基質金屬蛋白酶（MMP）通路誘導其合成，促關節損壞[14]。MMPs是一類能夠降解基質中各型膠原纖維的蛋白酶，在細胞外基質的生理性和病理性降解過程中起重要作用。在軟骨的退行性變過程中，MMPs對Ⅱ型膠原纖維的降解起主要作用，其中，MMP-13對Ⅱ型膠原纖維的降解能力是其他MMPs的10～30倍，而其他膠原纖維酶發揮降解作用也需要MMP-13的參與[15]。

本研究對187個靶點涉及的信號通路進行了KEGG分析，結果顯示，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、核因子kappaB（NF-κB）信號通路、低氧誘導因子（HIF）-1信號通路等軟骨細胞凋亡相關信號通路被顯著富集。MAPK信號通路是介導骨性關節炎軟骨損傷重要的信號轉導系統，其激活可引起MMP表達增加、軟骨細胞凋亡、軟骨受損等一系列反應[16]。NF-κB病理性的激活參與了多種炎性反應和骨性關節炎的發生與發展[17]，其在調節炎性反應的同時調節軟骨細胞的凋亡[18]。HIF是在低氧狀態下機體調節的關鍵轉錄因子，可調節血管生成、細胞凋亡、細胞遷移、血管舒縮、能量代謝等相關基因[19]。軟骨細胞的增殖與分化可影響機體組織的生長發育和逆轉骨性關節炎進程[20]。蒼膝通痹膠囊作用靶點富集分析結果顯示，DNA復制、Notch信號通路及Wnt信號通路是其重要的調控軟骨細胞增殖的信號通路。Notch信號通路能夠維持軟骨細胞表型，平衡軟骨基質代謝，在調控軟骨細胞的增殖和分化方面起著重要的作用[21]。Wnt/β-catenin信號通路主要通過多種具有差異的方式來調控機體發育過程中的細胞增殖與分化[22]。故蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎的主要作用機制是多因素誘導的綜合效應，與多條信號通路密切相關，相關信號通路之間在細胞內即各自獨立，又相互聯系，形成一個復雜的交聯關系。

蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎活性成分共27個，相對應的治療靶點187個，由于靶點數目繁多，本研究對187個靶點進行了數據統計，度的平均值為6，我們選取大于度平均值的20個靶點進行GO分析，將27種主要藥物化合成分與骨性關節炎關鍵炎性因子IL-1、TNF及MMP-13進行分子對接。結果顯示，各成分對接后獲得結合能十分理想，均小于結合能標準值-5，說明蒼膝通痹膠囊可降低炎性誘導因子表達，對骨性關節炎具有明顯的治療作用，可保護骨性關節炎關節軟骨。我們進一步行體外細胞實驗，采用ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、TNF-α的表達水平。結果顯示，空白組IL-1β、TNF-α表達水平最低，模型組最高，表明10 ng/mL的IL-1β可以引起軟骨細胞退變；與模型組的炎性因子表達相比，DMSO組與前者表達近似，二者無明顯統計學差異，表明DMSO對骨性關節炎軟骨細胞炎性因子無影響，在濃度低于0.1%時應用DMSO溶液作為溶劑是合理的。與模型組的炎性因子表達水平相比，蒼膝通痹膠囊藥物組、塞來昔布組均可以有效降低退變軟骨細胞炎性因子的表達，表明蒼膝通痹膠囊與環氧合酶2（COX2）抑制劑塞來昔布作用相似，具有治療骨性關節炎保護關節軟骨的作用。

綜上所述，本研究通過系統藥理學技術，分析蒼膝通痹膠囊組方依據，探討其治療骨性關節炎的作用機制，利用分子對接技術和動物體外實驗證明其治療作用的確定性。結果表明，蒼膝通痹膠囊多種成分可作用于同一個靶點，同一成分參與了多個靶點的治療，提示蒼膝通痹膠囊是通過多成分、多靶點進行骨性關節炎治療及關節軟骨保護的。今后，本課題組將根據網絡對接獲得的靶點進行進一步的體內實驗研究，以期為蒼膝通痹膠囊治療骨性關節炎提供更多的實驗及臨床依據。