2種不同配方飼料構建高脂血癥合并脂肪肝模型的實驗研究

鄭立新，董鵬，吳玉平，蔡祥焜，孟慶金，田世民

[1.中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心，北京 100123；2.中檢科（北京）測試技術有限公司，北京 100176；3.檢科測試集團有限公司，北京 100176]

隨著生活水平的提高和生活節奏的加快，高脂飲食結構和缺乏運動的生活方式，導致高脂血癥（hyperlipidemia）、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等代謝性疾病的發病率呈逐年上升的趨勢[1]。在我國人群中高脂血癥患者高達40%[2]，高脂血癥可引發動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病[3]。NAFLD已成為最常見的肝病（占總人口的30%）[4]，可能會發展為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic fatty hepatitis，NASH）及肝硬化、肝癌等，其中近40%的NAFLD患者可發展為更嚴重的NASH[5]。流行病學調查研究[6]顯示，在高甘油三酯、高膽固醇、混合型高血脂中脂肪肝的檢出率分別達82.93%、17.48%、73.25%。因此，建立符合高脂血癥合并NAFLD臨床證型的動物模型，并在此基礎上闡明發病機制、病理特點，預防和治療的方法，具有重要的研究意義。目前，動物模型建立方法通常是喂飼8～12周高脂飲食誘發大鼠高血脂和脂肪肝，此方法符合人類脂代謝疾病的臨床病因病機、發病過程，具有簡便、重復性好、要求低、實驗條件易于控制、采血量大等優點[7-8]。但由于飼料配方、造模周期和實驗動物種屬的差異，制作動物模型的臨床證型有很大差異，且關注點多在血脂、肝病理學方面，而對體質量、攝食量及血清肝損傷指標的動態研究報道相比較少[9]。本研究以SD大鼠為研究對象，采用2種不同配方高脂飼料模擬人類高脂飲食而引起的高脂血癥合并脂肪肝，觀察大鼠體質量、攝食量、血清中血脂和轉氨酶的動態變化，終期對肝臟濕量、臟器指數及病理學變化進行比較，旨在為高脂血癥和NAFLD的發病機制、藥效評價和中醫方證相應研究提供參考和借鑒。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物36只SPF級健康成年雄性SD大鼠，體質量180～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0006]，動物飼養于中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心SPF級動物房[SYXK（京）2016-0011]，自由攝入食水，動物房溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，明暗交替12 h∶12 h，適應性喂養7 d。本實驗經中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心實驗動物倫理委員會審批，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器血脂質控、定標液和多項復合質控試劑由RANDOX提供；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）檢測試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供。TBA-120FR全自動生化分析儀（日本東芝公司）；4-5R離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）；ES-MV小動物麻醉機（北京眾實科技有限公司）；BSA2202S-CW動物天平（德國賽多利斯公司）；CX31顯微鏡（德國奧林巴斯公司）；包埋、脫水、切片和染色機（日本櫻花精機株式會社）；WF-PRO-005病理切片掃描儀（寧波江豐生物信息技術有限公司）。

1.3 2組高脂飼料的配方①模型I配方：參考保健食品混合型高血脂造模飼料配方[9]，在維持飼料中添加質量分數20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，12%酪蛋白、1.8%磷酸氫鈣、0.6%石粉、0.2%食鹽，實測飼料中粗脂肪含量為18.07%，粗蛋白含量為19.46%。②模型Ⅱ配方自行設計：在維持飼料中添加質量分數5%蔗糖、10%豬油、蛋黃粉5%、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、5%酪蛋白、1.1%磷酸氫鈣、0.3%石粉，實測飼料中的粗脂肪為18.39%，粗蛋白為19.79%。高脂飼料制作方法：將原料混合均勻后，將之再經攪拌，壓成圓條狀顆粒，真空包裝后，經Co-60輻照消毒，除粗脂肪外，其他營養成分指標均滿足GB 14924.3-2010的要求。維持飼料中粗脂肪為5.3%，粗蛋白含量為20%。以上飼料均由北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0008]提供。

1.4 動物分組與模型制備適應期結束后，按體質量隨機分為3組，每組12只，對照組給予SPF級標準維持飼料，模型Ⅰ組給予配方Ⅰ高脂飼料，模型Ⅱ組給予配方Ⅱ高脂飼料，喂養7周，自由飲水。

1.5 體質量與攝食測定每周稱量1次體質量和2次飼料的剩余量和撒食量，直到實驗結束。計算體質量增加值、攝食量、總食物利用率（%）。總食物利用率（%）=總增質量（g）/總攝食量（g）×100%。

1.6 血清學指標檢測在喂養1周后，不禁食水，異氟烷麻醉后，用毛細吸管從眼眶靜脈叢采血約1.2 mL，離心分離血清，全自動血生化儀測定血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。處死前用1%戊巴比妥鈉麻醉，經腹主動脈采血，全自動血生化儀測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT的水平。檢測相關的血生化指標。

1.7 肝指數測定和肝病理學檢查采血后，摘取肝臟，檢查其形狀、大小、顏色，用4℃0.9%氯化鈉溶液沖洗肝臟組織，擦干后，稱定肝臟質量，計算肝指數（%）。肝指數（%）=肝臟質量（g）/終體質量（g）×100%。

肝臟病理學檢查：以福爾馬林固定，制成石蠟切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色，分別在低倍鏡（×10）、高倍鏡（×40）下觀察肝組織的病理學改變。并按肝臟脂肪變分級標準分級[10]，重度（3級）：脂肪變肝細胞超過肝小葉2/3；中度（2級）：脂肪變細胞占肝小葉1/3～2/3；輕度（1級）：脂肪變肝細胞呈散在小灶分布；無（0級）：肝小葉結構完好，基本無脂肪變。

1.8 統計方法實驗數據錄入計算機，以Excel軟件建立數據庫，采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同配方高脂飼料對大鼠外觀及行為的影響在整個實驗過程中，對照組大鼠精神狀態良好，活動自如，皮毛正常、無明顯脫落。2個造模組在實驗后期（5～7周），大鼠精神狀態一般，不喜運動，皮毛粗糙無光澤，毛發易脫落，而模型Ⅰ組較模型Ⅱ組的癥狀更為明顯。

2.2 不同配方高脂飼料對大鼠體質量、攝食量影響的時序性變化整個實驗周期內，大鼠體質量增長速度排序：模型Ⅰ組＞模型Ⅱ組＞對照組。其中，在2～7周模型Ⅰ組大鼠體質量較對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），而模型Ⅱ組各周大鼠體質量較對照組有升高趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖1。

圖1 2種配方高脂飼料對大鼠體質量的影響Figure 1 Effects of two formulations of high-fat feed on body mass in rats

大鼠每周攝食量：對照組＞模型Ⅱ組＞模型Ⅰ組。模型Ⅰ組大鼠1～7周攝食量均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；模型Ⅱ組大鼠第3、4、5、7周攝食量和總攝食量低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 2種配方高脂飼料對大鼠食物攝入量的影響Figure 2 Effects of two formulations of high-fat feed on food intake in rats

總食物利用率（%）排序：模型Ⅰ組[（26.16±3.36）%]＞模型Ⅱ組[（21.77±3.74）%]＞對照組[（17.81±1.50）%]。與對照組比較，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組的總食物利用率升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。表明模型Ⅰ、Ⅱ組大鼠無拒食現象，體質量一直保持上升，提示SD大鼠對2種高脂飼料配方均有很好的適應性。

2.3 不同配方高脂飼料對大鼠血清生物化學指標的影響造模前，與對照組比較，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組血清生化指標差異無統計學意義（P＞0.05），表明動物隨機分組均勻。模型Ⅰ組：與對照組比較，造模第1、5、7周，大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），造模第1周，HDL-C水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），表明本飼料配方升高血清TC、TG、LDL-C水平，隨著飼養時間延長至7周時，效果可以維持。模型Ⅱ組：與對照組比較，造模第1周，大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），隨著飼養時間延長，在造模第5、7周的大鼠血清中TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），但是血清TG水平在5、7周差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。結果表明，模型Ⅰ組大鼠血清TG、TC、LDC-C維持在較高水平，提示混合型高血脂模型成立；模型Ⅱ組大鼠血清TC、LDC-C維持在較高水平，提示高膽固醇模型成立。

表1 2種配方高脂飼料對大鼠轉氨酶和血脂的影響Table 1 Effects of two formulations of high-fat feed on transaminase and blood lipids in rats（±s，mmol·L-1；n=12）

表1 2種配方高脂飼料對大鼠轉氨酶和血脂的影響Table 1 Effects of two formulations of high-fat feed on transaminase and blood lipids in rats（±s，mmol·L-1；n=12）

①P＜0.05，②P＜0.01，與對照組比較

組別對照組采血時間/周模型Ⅰ組模型Ⅱ組ALT 59.78±6.52 60.41±7.88 59.87±8.44 59.44±8.51 57.50±8.63 57.98±7.36 58.92±7.14 70.13±14.02①58.40±6.00 65.16±6.89 74.80±9.53②80.17±14.36②015701570157 TC 2.35±0.32 2.05±0.40 2.05±0.40 1.91±0.35 2.38±0.28 3.05±0.75②3.04±0.77①3.15±0.82①2.34±0.37 2.64±0.47①2.63±0.56①2.57±0.68①TG 1.25±0.34 1.43±0.49 1.57±0.46 1.42±0.47 1.20±0.33 3.44±1.49②3.35±2.05②2.16±0.80①1.43±0.41 2.26±0.67②2.54±1.16 1.90±0.69 LDL-C 0.65±0.12 0.49±0.12 0.45±0.10 0.38±0.11 0.64±0.11 1.08±0.33②0.96±0.38②1.29±0.48②0.60±0.15 0.89±0.20②0.74±0.20②0.95±0.37②HDL-C 1.14±0.18 1.01±0.24 1.10±0.24 1.02±0.22 1.19±0.14 0.82±0.11①0.82±0.12②0.84±0.13①1.18±0.20 0.87±0.16 0.85±0.19②0.82±0.21①AST 121.30±5.71 125.93±11.26 124.17±11.64 133.03±11.02 125.38±9.76 128.78±11.21 145.36±23.21①160.66±16.59②127.63±17.27 121.05±19.87 135.79±20.22 153.79±28.34①

TG水平升高是NAFLD的主要特征[1-2，5]，相似的結論在許多動物試驗中也被證實[7-8，10]。當大鼠高脂飲食后，進入肝內的脂肪酸過多，肝內脂肪酸β氧化障礙，TG的合成超過其轉運出肝臟的能力，過多的脂肪酸在肝細胞內沉積，造成肝細胞脂肪變性，還會引起線粒體的腫脹和通透性的增加，線粒體為脂肪酸分解代謝β-氧化的主要場所，導致氧化應激和脂質過氧化[11-13]。迄今為止，AST和ALT是國內外應用最廣泛的反映肝細胞損害的指標，當肝細胞膜通透性增加時，會導致肝細胞漿中存在的ALT大量釋放入血液，而肝細胞中的線粒體受損害會導致大量AST釋放到血液中，當血液中AST和ALT水平升高，提示肝臟受損或損壞，ALT在反映急性肝細胞損傷時最為敏感，而AST反映其損傷程度時最為敏感[14-17]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型Ⅰ組大鼠在造模第5、7周AST升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），ALT在造模第7周升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型Ⅱ組大鼠在造模第7周AST水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05），在造模第5、7周ALT水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果提示，2個模型組均隨著食用高脂飼料時間的延長，出現肝損傷，模型Ⅰ組先出現肝細胞內線粒體損傷，后出現肝細胞膜損傷，模型Ⅱ組先出現肝細胞膜損傷，后出現線粒體的損傷。

2.4 大鼠肝臟濕質量、指數及病理組織學檢查

2.4.1 肝臟濕質量和肉眼觀察臟器指數是動物實驗中常用的生物學指標，其大小可反映器官的功能強弱和損傷情況，臟器指數增加表示臟器有充血、水腫、增生及肥大等變化，下降表示臟器萎縮、生長受阻或退行性變化，采用肝濕質量和肝臟指數等一般性指標表觀評價飼料對大鼠肝臟內脂肪蓄積[18]。本研究解剖結果可見：對照組大鼠肝臟呈暗紅色、邊緣銳利、質韌；2個模型組大鼠肝臟體積增大，外觀呈淡黃色，邊緣較鈍，質地較脆，切面帶油膩感，2個模型組大鼠肝臟外觀上無差異。由表2可見，2個模型組肝臟濕質量和指數均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），其中，模型Ⅰ組大鼠的肝臟濕質量是對照組的1.8倍，模型Ⅱ組大鼠的肝臟濕質量是對照組的1.6倍，大鼠肝指數排序：模型Ⅰ組＞模型Ⅱ組＞對照組。結果表明，隨著飼料中脂肪、蔗糖含量提高，導致大鼠肝臟內脂肪蓄積量升高。

表2 2種配方高脂飼料對大鼠肝臟濕質量及指數的影響Table 2 Effects of two formulations of high-fat feed on liver wet mass and index in rats （±s；n=12）

表2 2種配方高脂飼料對大鼠肝臟濕質量及指數的影響Table 2 Effects of two formulations of high-fat feed on liver wet mass and index in rats （±s；n=12）

①P＜0.05，②P＜0.01，與對照組比較

組別對照組模型Ⅰ組模型Ⅱ組肝臟指數/%3.46±0.18 5.35±0.50②5.08±0.66②肝臟濕質量/g 16.22±1.60 29.03±3.72②26.22±5.90②終體質量/g 468±37 545±41①506±55

2.4.2 顯微鏡觀察對照組：肝小葉結構完整，肝竇清晰可見，肝索放射狀排列規則，肝細胞大小均勻一致，胞核呈圓形，位于細胞中央，形態規則（見圖3-a1～a2）。模型Ⅰ組：在低倍鏡下可見，肝小葉中央區域肝索尚清晰，肝細胞胞漿中空泡較小，小葉邊緣區肝細胞呈大空泡狀，肝索排列不清。高倍鏡下可見，肝小葉邊緣肝細胞腫大呈空泡狀，部分細胞的細胞核受擠壓偏于一側或細胞核消失，形成戒指狀細胞。中央區域肝細胞胞漿疏松呈泡沫狀，核位于細胞中央，肝小葉脂肪變細胞均超過90%，達到重度（3級）脂肪肝水平，偶見小葉內、匯管區有炎性細胞浸潤灶和少量的壞死肝細胞，無纖維化（見圖3-b1～b2）。模型Ⅱ組：低倍鏡下可見，肝小葉結構可辨認，肝索放射狀排列規則，中央區域胞漿致密，邊緣區域胞漿疏松呈泡沫狀，核位于細胞中央。高倍鏡下可見，肝小葉邊緣細胞質內可見彌漫分布的小空泡，肝細胞略有腫脹，大小不一，細胞核位于中央，中央區域接近正常，肝小葉脂肪變細胞占60%～70%，達到中度（2級）脂肪肝水平，匯管區有少量的炎性細胞浸潤，無纖維化（見圖3-c1～c2）。與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ組肝細胞腫脹度低，細胞質內呈彌散狀微小空泡，且含大空泡的肝細胞數目少，脂肪肝程度降低。結果表明，隨著飼料中脂肪、蔗糖含量減少，模型大鼠脂肪肝程度降低。2種高脂飼料的脂肪肝模型復制成功率均能達到100%。

圖3 各組大鼠肝臟病理學形態比較Figure 3 Comparison of the pathological morphology of the liver in various groups of rats

3 討論

高脂飼料由于蔗糖和豬油的含量太高，具有飽腹感，不易被消化，鼠料變軟，有異味，不利于采食等缺點[19]。本研究采用的配方Ⅰ高脂飼料含有質量分數20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，是用于保健食品輔助降血脂功能評價中的混合型高脂血癥造模飼料，結果顯示，模型Ⅰ組大鼠體質量增長速度過快，出現了精神差、毛發粗糙、易脫落等高脂帶來的副作用。在高脂飼料中加入2%～15%蛋黃粉主要是提供充足的脂肪和蛋白質，而且適口性好，攝入量增加，提高模型成功率[20-22]。為了研究不同類型高血脂和不同程度脂肪肝的大鼠模型，改良高脂飼料配方時，在降低蔗糖比例至5%，豬油比例降至10%的基礎上，膽固醇和膽酸鈉比例不變，蛋黃粉比例為5%。本研究結果顯示，飼料配方改良后，模型Ⅱ組大鼠體質量增長速度降低，同時期的攝食量升高，精神狀態以及毛發粗糙、易脫落的現象有改善，模型Ⅰ組大鼠喂飼7周的平均體質量超過對照組的16.5%。若采用體質量超過對照組平均體質量10%為肥胖標準[23]，模型Ⅰ組大鼠已形成肥胖，模型Ⅱ組平均體質量超過對照組8.1%，未達到肥胖標準，配方Ⅱ飼料適用于非肥胖高脂血癥合并NAFLD的防治研究。

本研究結果顯示，模型Ⅰ組大鼠造模第1周大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均顯著增加，HDL-C水平顯著降低，符合混合型高脂血癥模型成立的條件，到第5、7周時仍成立，表明配方Ⅰ高脂飼料可成功復制混合型高血脂模型，且造模效果穩定，適合應用于保健食品降血脂功能的評價。此外，模型飼料喂養期間，模型組TC水平比較穩定，TG水平逐漸降低，故模型飼料給予時間不能超過7周。通過與本實驗室前期研究結果[24]對比發現，提高飼料中蛋白質的含量可以促進大鼠體質量增長，各階段的大鼠體質量明顯高于維持飼料組，造模1周時血清TG水平由（2.34±0.81）mmol/L升高到（3.44±1.49）mmol/L，提高了1.1 mmol/L。模型Ⅱ組造模時間延長至5周，大鼠血清TG水平恢復正常，TC、LDL-C維持在較高水平，表明配方Ⅱ高脂飼料可用于建立高膽固醇模型。因飼料配方不同，結果與文獻報道有差異，如：陳劍峰等[25]采用12%豬油、10%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽鹽的高脂飼料喂養大鼠8周時，TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C差異無統計學意義；孫林林等[26]報道采用82.5%普通飼料、2%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉構建模型喂養大鼠8周時，TG、CHO水平升高，LDL-C、HDL-C差異無統計學意義；樓琦等[11]采用配方為普通飼料80.5%、蛋黃粉10%、豬油7%、膽固醇2%、膽鹽0.5%的高脂飼料喂養大鼠4周時，TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低。

本研究結果顯示，模型Ⅰ組大鼠造模5周時血清AST升高，在造模7周時ALT、AST均升高，提示先出現大鼠肝臟線粒體損傷，隨著脂質在肝臟細胞內累積導致細胞膜損傷。模型Ⅱ組到造模5周時血清ALT升高，第7周時ALT、AST均升高，提示先出現大鼠肝臟細胞膜損傷，后出現線粒體損傷。孫林林[26]、尹抗抗[18]等報道采用脂肪10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉5%、標準大鼠飼料82.5%的高脂飼料造模8周時ALT、AST水平升高，與本研究結果相似。模型Ⅰ組大鼠肝臟體積、濕質量和肝系數均增大，肝臟組織HE染色結果可見肝臟脂肪變達到重度（3級）水平，小葉內、匯管區有炎性細胞浸潤和少量的壞死肝細胞，未見纖維化，與孫秀娥、蔡拓、于蘭蘭等[27-29]的文獻報道均相似。模型Ⅱ組大鼠肝臟體積、濕質量和肝系數均增加，肝臟脂肪變達到中度水平，有少量的炎性細胞浸潤，未見肝纖維化，與孫林林[26]、尹抗抗等[18]報道的肝臟脂肪變等級一致。孫林林等[26]在研究中發現大鼠肝纖維化，原因可能是飼料配方和造模周期有差異。

綜上所述，本研究采用的2種高脂鼠料均成功建立了高脂血癥合并NAFLD模型，配方Ⅰ高脂飼料構建了混合型高脂血癥合并重度脂肪肝模型，配方Ⅱ高脂飼料構建了高膽固醇血癥合并中度脂肪肝模型，并且2個模型在體質量、生化指標、肝臟病理上有各自特點，可以為建立高血脂癥及脂肪肝的動物模型提供參考。另外，本研究不足之處是大鼠模型出現類似于人類脂肪肝的生化改變，在肝臟病理學上也出現了輕微炎癥，但肝病變程度并不嚴重，缺乏肝臟炎癥和纖維化進行性過程，并且其造模時間也相對較長。后期研究上可以優化飼料成分，在不嚴重影響營養平衡的前提下，適當增加其他飲食因素，以放大NASH病癥的嚴重程度以及觸發纖維化效應。