小窩蛋白-1對N-甲基-D天冬氨酸誘導的腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白帶狀閉合蛋白1的破壞作用研究*

毛鳳萍，黃 芳，農偉東，勞大媛，龔卓偉，黃 文

（廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，南寧 530021）

血腦屏障由腦血管內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞和神經元組成，被稱為“神經血管單元”。腦血管內皮細胞通過緊密連接蛋白復合物連接在一起，形成一個選擇性屏障，將外周循環與中樞神經系統隔離，從而維持大腦穩態和神經元功能[1]。血腦屏障完整性的喪失導致血管通透性增加，使血液來源的毒性分子、細胞和微生物進入大腦，參與炎癥和免疫反應[2]。部分神經系統疾病伴有血腦屏障功能障礙，如中風、癲癇、創傷性腦損傷和神經退行性疾病等[3-6]。但這些疾病中血腦屏障功能障礙的機制尚不完全清楚。

帶狀閉合蛋白1（ZO-1）是構成內皮細胞緊密連接重要成分之一，其表達下調或在內皮細胞中重分布都會影響細胞間緊密連接的形成[7]。N-甲基-D天冬氨酸（N-methyl-D aspartic acid，NMDA）是一種谷氨酸類似物，可以激活NMDA 受體（NMDA receptor，NMDAR）。在中樞神經系統中，NMDAR 主要分布于前額葉皮質、海馬、杏仁核和下丘腦，它們不僅參與調節神經元的存活和神經元樹突、軸突的發育，還參與突觸可塑性的形成和學習、記憶、情緒等較高的神經活動[8]。過量的谷氨酸釋放通過激活NMDAR 增加大鼠大腦皮層血管的通透性[9]。最近的研究也表明，NMDA與腦血管內皮細胞功能障礙有關[10]。然而，NMDA損傷腦血管內皮細胞的分子信號調節機制尚不完全清楚。小窩蛋白（Caveolin-1，Cav-1）是小窩的主要結構蛋白，廣泛表達于各種組織中，它包含一個腳手架結構域，可以與多種信號蛋白結合。Cav-1的中間跨膜區形成一個發夾狀結構，允許Cav-1嵌入膜中，使其成為信號轉導的關鍵調節器[11]。有證據表明，Cav-1與許多信號分子相互作用，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）[12]。通常，根據所研究的細胞類型和特定的細胞信號通路，Cav-1 可作為細胞信號負或正調節因子[13-15]。既往的研究發現，Cav-1在人腦微血管內皮細胞（HBEC-5i）上表達，沉默Cav-1 可有效地保護HIV Tat 誘導的HBEC-5i 中緊密連接蛋白occludin 表達減少[16]。然而，Cav-1在NMDA誘導的緊密連接蛋白ZO-1和血腦屏障完整性破壞之間的相互作用機制尚不完全清楚。本研究旨在探討Cav-1 在NMDA 誘導的緊密連接蛋白ZO-1 和血腦屏障完整性破壞中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 DMEM:F12 培養基（ATCC，美國）；胎牛血清（FBS）（Gibco，美國）；內皮細胞生長因子（ECGS，ATCC）；青霉素100 U/mL 和鏈霉素0.1 mg/mL（碧云天，中國）；NMDA、MK801（Sigma，美國）；Daidzein（MCE，中國）；CCK-8試劑盒（同仁化學研究所，日本）；兔抗GAPDH 單克隆抗體（Proteintech，中國）；兔抗ZO-1 單克隆抗體，兔抗NMDAR單克隆抗體（Abcam，美國）；兔抗Cav-1單克隆抗體、兔抗p-Cav-1 多克隆抗體（CST，美國）；山羊抗兔熒光二抗（LI-COR Biosciences；美國）；TRIzol、TaqPCR MasterMix kit、逆轉錄試劑盒（Takara，日本）。

1.1.2 主要試劑配制 置NMDA、MK801于純水中溶解，分別制成100 mmol/L、10 mmol/L 儲存液，于-20 ℃冰箱保存。含10%FBS DMEM:F12 培養基中加入0.8%ECGS、1%青霉素—鏈霉素，配置成DMEM:F12完全培養基[16]。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養瓶預處理 用0.1%明膠溶液將T25培養瓶進行包被，包被后放置于37 ℃，含5%CO2培養箱45 min備用[16]。

1.2.2 細胞培養 HBEC-5i 培養于盛有3～5 mL DMEM:F12 完全培養基且用膠包被的T25 培養瓶中，置于37 ℃，含5%CO2培養箱孵育，視細胞生長情況2～3 d換液。當細胞融合率達80%～90%時，可對細胞進行傳代。

1.2.3 NMDA對HBEC-5i細胞活力的影響 CCK-8法檢測細胞的活力。將HBEC-5i接種在96孔板上，濃度梯度設4 個復孔，置于培養箱中培養24 h。分別用含有0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L 或10 mmol/L NMDA 的完全培養基孵育24 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，用酶標儀測量吸光度值（波長450 nm）。

1.2.4 實驗分組及處理 將HBEC-5i 接種在12 孔板transwell 小室的上室，每天用電阻儀Millicell ERS Volt-Ohm meter（World Precision Instruments，美國）測量并記錄跨內皮細胞膜電阻（TEER）值。計算TEER值：（實驗組TEER-空白對照組TEER）×1.11（cm2）[17-18]。當TEER值達平穩期時，根據不同的實驗目的分組干預。為了探索內皮細胞NMDAR在ZO-1破壞中的作用，分為以下實驗組：對照組（完全培養基）、NMDA組（2.5 mmol/L NMDA）、MK801組（10 μmol/L MK801）、MK801+NMDA組（10 μmol/L MK801預處理2 h+2.5 mmol/L NMDA）。為了進一步研究Cav-1在NMDA誘導的ZO-1破壞中的作用，分為以下實驗組：對照組（完全培養基）、NMDA 組（2.5 mmol/L NMDA）、Daidzein 組（10 μmmol/L Daidzein）、Daidzein+NMDA 組（10 μmol/L Daidzein 預處理2 h+2.5 mmol/L NMDA）。24 h 后測量各組TEER值，并收集細胞以備后續實驗使用。

1.2.5 蛋白免疫印記（western blotting）分析 細胞用藥物處理后，PBS洗滌3次，冰上細胞組織快速裂解液裂解30 min，4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清液。BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。用8%～10%SDS-PAGE 分離蛋白并轉移到PVDF 膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1h，用下列一抗4°C冰箱孵育過夜：ZO-1（1∶400），Cav-1（1∶1 000），p-Cav-1（1∶1 000），GAPDH（1∶5 000）。第2 天加熒光二抗（1∶20 000）室溫孵育1 h 后用熒光掃膜儀掃膜，利用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以ZO-1灰度值與內參GAPDH 灰度值的比值反映ZO-1 蛋白相對表達量；以p-Cav-1灰度值與Cav-1灰度值的比值反映p-Cav-1蛋白相對表達量。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測ZO-1 mRNA表達 藥物干預后收集細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA。逆轉錄試劑盒合成cDNA 后，經Step One Plus Real-Time PCR 系統按試劑盒說明書擴增。以2-ΔΔCT法計算ZO-1 mRNA相對表達量，每個樣品使用GAPDH 作為內參使目標基因標準化。引物設計參照之前的研究[19]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，數據均來自每組至少3次獨立實驗。各組間的差異通過單因素方差分析（ANOVA）進行對比，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度NMDA對HBEC-5i活力的影響

不同濃度NMDA孵育HBEC-5i 24 h，以0 mmol/L組為對照，NMDA 大于2.5 mmol/L 時，對HBEC-5i的活力有明顯的抑制作用（P＜0.001）。且隨著NMDA濃度升高，其對HBEC-5i活力的抑制作用明顯增強。因此，在后續實驗中選用NMDA 不影響HBEC-5i活力的2.5 mmol/L作為處理濃度，見圖1。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度NMDA對HBEC-5i活力的影響

2.2 NMDAR 的激活增加HBEC-5i 中緊密連接蛋白ZO-1的破壞

與對照組相比，NMDA 組ZO-1 的蛋白（0.32±0.14）和mRNA（0.57±0.09）水平均顯著降低（均P＜0.01）。然而，HBEC-5i 用MK801（10 μmol/L）預處理2 h后再用NMDA（2.5 mmol/L）孵育24 h，結果顯示，MK801 預處理逆轉了NMDA 誘導的ZO-1 蛋白和mRNA的下調（均P＜0.05），見圖2。

圖2 Western blotting和RT-qPCR分別檢測MK801預處理后HBEC-5i ZO-1蛋白和mRNA水平

2.3 Cav-1 在NMDA 誘導的緊密連接蛋白ZO-1 破壞中的作用

與對照組相比，NMDA 組p-Cav-1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），ZO-1 蛋白水平下調（P＜0.01）。然而，在NMDA 孵育前先用Cav-1 抑制劑Daidzein 預處理2 h，結果顯示，與NMDA 組相比，Daidzein 預處理組不僅下調了p-Cav-1 蛋白表達水平（P＜0.05），而且保護了NMDA 誘導的ZO-1 蛋白（P＜0.05）和mRNA（P＜0.000 1）的下調，見圖3。

圖3 Cav-1抑制劑Daidzein預處理后檢測HBEC-5i ZO-1蛋白和mRNA水平

2.4 藥物干預后各組TEER值的測定

2.5 mmol/L NMDA 孵育24 h 后，HBEC-5i 血腦屏障模型的TEER 值顯著降低（P＜0.001），說明HBEC-5i構建的緊密連接屏障的完整性被破壞。然而，MK801（10 μmol/L）阻止了NMDA 誘導的緊密連接屏障完整性破壞（P＜0.001）。此外，Daidzein預處理可阻斷HBEC-5i血腦屏障模型TEER值的降低（P＜0.001），表明Cav-1 可能參與了NMDA 誘導的緊密連接屏障完整性破壞的調節,見圖4。

圖4 MK801、Daidzein預處理后血腦屏障模型TEER值測定

3 討論

Mehra 等[20]發現NMDAR 激活與腦血管內皮細胞功能障礙有關。NMDA 降低了腦微血管內皮細胞中緊密連接蛋白的表達，增加了血腦屏障的通透性[10-11]。然而，NMDA 如何誘導腦微血管內皮細胞中緊密連接蛋白的破壞，增加血腦屏障的通透性，目前尚不完全清楚。NMDAR過度激活導致興奮性毒性神經元丟失[21-22]。過去的體外或體內實驗均表明，腦缺血部位釋放谷氨酸通過激活NMDAR 增加血管通透性，但NMDAR拮抗劑（MK801）可保護腦缺血部位的血管通透性的降低[9,23]。因此，NMDAR激活引起的興奮性毒性在腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白的破壞和血腦屏障功能障礙中起著重要作用。

過量的谷氨酸降低了腦血管內皮細胞緊密連接蛋白occludin 的表達和減少TEER 值[23]。Andras等[24]發現MK-801 對NMDAR 的抑制可部分保護谷氨酸誘導的緊密連接蛋白occludin磷酸化并減少血管內皮細胞損傷。ZO-1 是構成緊密連接的最主要成分之一，在維持血腦屏障的完整性方面發揮著重要作用[7]。本研究表明，暴露于NMDA 可降低腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白ZO-1 的表達和減少血腦屏障模型的TEER值。然而，MK-801預處理可拮抗NMDAR活化誘導的緊密連接蛋白ZO-1的減少，從而減少血管內皮細胞的損傷（P＜0.05）。這些結果表明，激活HBEC-5i 中的NMDAR 可誘導腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白的破壞，從而增加血腦屏障的通透性。

小泡是一種特殊類型的脂筏，主要存在于人體的上皮細胞、內皮細胞、脂肪細胞和成纖維細胞中。本課題組之前的研究表明，Cav-1 在HBEC-5i的質膜中表達，并在HIV-1 Tat介導的緊密連接蛋白破壞中發揮重要的調節作用[16]。然而，Cav-1是否參與了NMDA誘導的HBEC-5i中緊密連接蛋白ZO-1的破壞尚不清楚。在本研究中，用Cav-1 抑制劑Daidzein抑制HBEC-5i中Cav-1的表達，評估Cav-1在NMDA 誘導的緊密連接蛋白破壞中的作用。結果支持之前的研究，證實Cav-1 在HBEC-5i 質膜中表達[16]。此外，本研究還發現，HBEC-5i 在暴露于NMDA 24 h后，其Cav-1磷酸化蛋白水平顯著升高，且在使用Cav-1抑制劑Daidzein抑制HBEC-5i細胞中Cav-1 的表達后，與NMDA 組相比，Daidzein +NMDA組Cav-1磷酸化蛋白水平降低。同時，Daidzein 可以有效地防止NMDA 誘導的ZO-1 表達的減少和HBEC-5i 血腦屏障模型TEER 值的降低（P＜0.05）。這些結果進一步表明，Cav-1 可能參與調節NMDA 誘導的腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白ZO-1的表達和血腦屏障的完整性的維持。

綜上所述，NMDAR拮抗劑MK801、Cav-1抑制劑Daidzein 預處理對NMDA 誘導的HBEC-5i 中ZO-1 表達下降和血腦屏障模型TEER 值降低具有顯著的保護作用。這些發現，闡明了NMDA誘導的腦微血管內皮細胞緊密連接蛋白破壞的可能機制。MK801 對NMDA 誘導的緊密連接屏障功能障礙具有潛在的保護作用。靶向研究Cav-1相關信號可能是治療血腦屏障功能障礙的神經系統疾病的一種有前景的方法。