秋水仙堿緩釋微丸對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的預(yù)防作用研究*

韋業(yè)娟，呂 白，雷雅然，楊國(guó)寶，丁雅寧，王玉麗△，高春生，焦 楊

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，齊齊哈爾 161006；4.沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽(yáng) 117004）

痛風(fēng)是一種由骨關(guān)節(jié)、腎臟、皮下和其他各種組織中單鈉尿酸鹽（MSU）晶體沉淀引起的急性或慢性炎癥和組織損傷的疾病[1]。我國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率為1%～3%，呈逐年上升的趨勢(shì)，且男性發(fā)病率比女性高約38%[2]。痛風(fēng)的反復(fù)發(fā)作會(huì)造成痛風(fēng)石沉積和痛風(fēng)腎病。

秋水仙堿，又名秋水仙素，是從百合科植物麗江山慈菇球莖中提取的一種三環(huán)類(lèi)生物堿。作為治療和預(yù)防急性痛風(fēng)的經(jīng)典藥物，秋水仙堿通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的聚集、黏附和吞噬作用，減少單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放前列腺素和白三烯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[3]?！吨袊?guó)高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南（2019）》指出，使用小劑量（0.5～1.0 mg/d）秋水仙堿3～6個(gè)月可預(yù)防痛風(fēng)發(fā)作[4-5]。雖然秋水仙堿在常規(guī)劑量下耐受性良好，但其治療窗很窄，有效劑量和中毒劑量十分接近。據(jù)報(bào)道，臨床上單次劑量低至7 mg 即可致死[6]。秋水仙堿毒性較大，往往產(chǎn)生一定的副作用，臨床最常見(jiàn)的不良反應(yīng)有惡心、嘔吐、食欲減退、腹瀉、體重下降等。因此，如何提高療效、減少不良反應(yīng)成為秋水仙堿使用的主要問(wèn)題[7]。然而，秋水仙堿在國(guó)內(nèi)上市的劑型僅為片劑，在FDA 批準(zhǔn)上市的劑型中除片劑和口服液體制劑也未見(jiàn)其他。

相較于普通片劑，緩釋微丸作為一種多單位制劑具有許多顯著優(yōu)勢(shì)，其體積小，與胃腸道的接觸面積增加，受食物節(jié)律的影響減小，單位制劑的缺陷不會(huì)影響藥效的發(fā)揮[8-10]。因此，本研究采用流化床包衣法制備了秋水仙堿緩釋微丸，考察其對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的預(yù)防效果，為秋水仙堿緩釋制劑的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 雄性大鼠，SPF 級(jí)，體重（300±20）g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。所有大鼠自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物和主要試劑 秋水仙堿（HPLC 測(cè)定純度98%以上，山西玉寧生物科技有限公司）；秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司）；空白丸芯（杭州高成生物營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司）。白細(xì)胞介素（IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Cr）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；尿酸鈉（北京英華錦程生物科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（美國(guó)ISP Technologies 公司）；乙基纖維素（EC，上?？?lè)康包衣技術(shù)有限公司）；羥丙基纖維素（HPC，美國(guó)亞什蘭公司）。

1.3 秋水仙堿緩釋微丸的制備 將30 g PVP-K30溶于500 g 蒸餾水中，60 ℃水浴下攪拌至全部溶解后加入6 g秋水仙堿原料藥，繼續(xù)攪拌至全部溶解，即得含藥包衣液。在流化床中將上藥液底噴于1 000 g空白微丸，干燥5 min后過(guò)篩稱(chēng)重，得到載藥微丸。稱(chēng)取50 g HPC 緩慢加入2 000 mL 95%乙醇中，60 ℃水浴持續(xù)攪拌至其全部溶解后，緩慢加入175 g EC，繼續(xù)攪拌至全部溶解，即得緩釋包衣液。在流化床中將緩釋包衣液底噴于500 g 載藥微丸，干燥20 min后過(guò)篩稱(chēng)重，得到緩釋微丸。

1.4 微觀(guān)形態(tài)學(xué)觀(guān)察 取少量緩釋微丸，將部分微丸進(jìn)行球心縱切得到橫截面，為待觀(guān)察樣品。將待觀(guān)察樣品于真空中進(jìn)行噴霧鍍金，然后在15 keV的加速電壓下進(jìn)行電鏡掃描觀(guān)察。

1.5 體外溶出試驗(yàn) 按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部，通則0931第二法（漿法），以500 mL水作為溶出介質(zhì)，溫度（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速75 r/min，依法操作。每隔一定時(shí)間自動(dòng)取樣5 mL（同時(shí)補(bǔ)加等體積等溫度的溶出介質(zhì)）經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液于高效液相色譜儀中檢測(cè)峰面積[色譜柱：Waters Symmetry?C8（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL]，并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放百分率。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組、給藥及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立 將24 只大鼠隨機(jī)分為4 組（n=6），分別為正常組、模型組、片劑組、緩釋微丸組。片劑組將秋水仙堿片研磨成粉，水溶后灌胃給藥，緩釋微丸組為保證微丸的完整性，通過(guò)特制的灌胃器灌胃給藥，給藥劑量均為1.2 mg/(kg.d)；正常組和模型組灌胃等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃14 d。第14天給藥1 h 后，正常組大鼠右后踝關(guān)節(jié)腔注射0.2 mL 生理鹽水，其余各組大鼠同部位注射0.2 mL 尿酸鈉（25 mg/mL）混懸液，建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作模型[11]，注射尿酸鈉后觀(guān)察到大鼠關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起，則可判斷造模成功[12]。

1.7 關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定 分別于造模前及造模后6 h、12 h、24 h、48 h，將大鼠固定，使用無(wú)彈性棉線(xiàn)，用記號(hào)筆標(biāo)記測(cè)量起始點(diǎn)，用棉線(xiàn)繞大鼠造模踝關(guān)節(jié)1 周，以不擠壓皮膚為準(zhǔn)，標(biāo)記測(cè)量終止點(diǎn)，測(cè)量起始點(diǎn)至終止點(diǎn)的長(zhǎng)度，即為大鼠關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，以測(cè)量3 次關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的平均值作為最終結(jié)果[13]。腫脹度/%=［（造模后關(guān)節(jié)周長(zhǎng)-造模前關(guān)節(jié)周長(zhǎng)）/造模前關(guān)節(jié)周長(zhǎng)］×100%

1.8 血清IL-1β 和TNF-α 含量測(cè)定 造模后48 h，大鼠常規(guī)麻醉后開(kāi)腹，取腹主動(dòng)脈血4 mL，靜置30 min后，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中IL-1β 和TNF-α 含量。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 踝關(guān)節(jié)炎性病理情況觀(guān)察 取血后處死大鼠，以其右后踝關(guān)節(jié)為中心上、下0.5 cm剪斷，去皮，固定于4%多聚甲醛溶液48 h。將踝關(guān)節(jié)放入10%EDTA液中脫鈣2周，使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（5 μm厚），置于65 ℃烤箱中烘烤1 h，行蘇木精—伊紅（HE）染色，倒置顯微鏡下觀(guān)察踝關(guān)節(jié)炎性病變[14]。

1.10 不良反應(yīng)評(píng)價(jià)（1）實(shí)驗(yàn)期間觀(guān)察并記錄各組大鼠的腹瀉情況。（2）比較給藥前（0 d）、給藥14 d后大鼠的攝食量，當(dāng)日攝食量=前1 d給食量-當(dāng)日剩余食量；給藥前及給藥期間每2 d 稱(chēng)1 次大鼠體重，以對(duì)用藥過(guò)程中產(chǎn)生的胃腸道不良反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。（3）給藥14 d后，通過(guò)大鼠眼眶靜脈叢穿刺采集血樣，離心，取血清，檢測(cè)血清中AST、ALT 和Cr 水平，以評(píng)價(jià)藥物對(duì)大鼠肝、腎功能的影響。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率（%）表示，組間比較采用Fisher’s 確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微丸的表觀(guān)形態(tài) 所制緩釋微丸表面較光滑，剖面可見(jiàn)完整的包衣膜、載藥層及空白丸芯，見(jiàn)圖1。

圖1 緩釋微丸表面及截面掃描電鏡圖（×200）

2.2 體外溶出結(jié)果 體外溶出曲線(xiàn)顯示，市售普通片劑中的秋水仙堿成分在15 min 內(nèi)快速釋放且體外累積釋放率達(dá)到80%以上，而自制緩釋微丸中的秋水仙堿成分緩慢釋放，在6 h 內(nèi)的體外累積釋放率達(dá)到80%以上，見(jiàn)圖2。

圖2 秋水仙堿片劑和緩釋微丸的體外溶出曲線(xiàn)

2.3 大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況 模型組大鼠受試關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯發(fā)紅腫脹，給藥組大鼠關(guān)節(jié)紅腫情況得到不同程度的改善，見(jiàn)圖3。與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯升高（P＜0.001），在12 h 時(shí)達(dá)到峰值，24 h后逐漸下降，符合痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的變化規(guī)律；與模型組比較，造模后各時(shí)間點(diǎn)緩釋微丸組關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低（P＜0.01），片劑組腫脹度顯著降低（P＜0.05）；造模后48 h，緩釋微丸組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度較片劑組明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 4組大鼠造模后12 h的踝關(guān)節(jié)對(duì)比

圖4 秋水仙堿緩釋微丸對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

2.4 大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量比較 與模型組比較，片劑組、緩釋微丸組血清中IL-1β 和TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），且緩釋微丸組大鼠血清中IL-1β 和TNF-α 含量顯著低于片劑組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量比較 pg/mL，，n=6

表1 4組大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量比較 pg/mL，，n=6

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與片劑組比較，△P＜0.05。

2.5 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化 正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜及周?chē)M織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組關(guān)節(jié)軟骨面粗糙不平，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有明顯的滑膜組織增生，炎性細(xì)胞在其中密集分布，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔間隙縮小。與模型組比較，片劑組和緩釋微丸組大鼠炎性病變明顯改善，其中緩釋微丸組的關(guān)節(jié)腔中無(wú)明顯滑膜組織增生，炎性細(xì)胞明顯減少，較片劑組炎性病變改善更為明顯，見(jiàn)圖5。

圖5 踝關(guān)節(jié)組織HE染色圖（×100）

2.6 大鼠腹瀉情況及體重變化 給藥期間，片劑組中4 只大鼠出現(xiàn)腹瀉，緩釋微丸組中1 只大鼠出現(xiàn)腹瀉，兩組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；正常組、模型組大鼠均未出現(xiàn)腹瀉。

給藥前，4 組大鼠體重比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；給藥14 d后，與正常組比較，片劑組大鼠體重顯著下降（P＜0.05），而緩釋微丸組體重?zé)o明顯差異（P＞0.05），與片劑組比較，緩釋微丸組大鼠的體重明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 4組大鼠體重變化

2.7 大鼠攝食量及肝、腎功能指標(biāo)比較 給藥前，各組大鼠攝食量比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；給藥14 d后，與片劑組比較，緩釋微丸組大鼠的攝食量明顯增加（P＜0.05），4 組大鼠血清AST、ALT、Cr 水平比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠攝食量及血清AST、ALT和Cr水平比較 ，n=6

表2 4組大鼠攝食量及血清AST、ALT和Cr水平比較 ，n=6

與正常組比較，**P＜0.01；與片劑組比較，△P＜0.05。

3 討論

MSU 沉積于關(guān)節(jié)腔會(huì)引起包括IL-1β、TNF-α在內(nèi)的炎癥因子的產(chǎn)生，抑制體內(nèi)IL-1β、TNF-α 的含量可緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥癥狀[15-16]。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作模型具有與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作相同的癥狀，該方法已被廣泛用來(lái)評(píng)估抗炎藥物的抗炎作用及抗炎機(jī)制研究[17]。尿酸鈉形成結(jié)晶后在關(guān)節(jié)腔中沉積可引起炎癥細(xì)胞在關(guān)節(jié)及周?chē)M織中積聚和浸潤(rùn)，同時(shí)引起滑膜組織增生和肥厚，關(guān)節(jié)液量增加，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹[18]。根據(jù)痛風(fēng)的分子機(jī)制研究，尿酸鈉結(jié)晶可直接刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α[19]，TNF-α 不僅可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，它的產(chǎn)生還可增強(qiáng)多形核白細(xì)胞釋放IL-1β的活性，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大，因此抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生是抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要途徑[20-21]。

本研究中藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，秋水仙堿普通片劑和緩釋微丸均可顯著抑制模型大鼠關(guān)節(jié)的腫脹度，顯著降低IL-1β、TNF-α的含量水平，并改善炎性病理情況，與片劑組比較，緩釋微丸降低腫脹度和IL-1β、TNF-α 含量的效果更顯著（P＜0.05）。秋水仙堿作為一個(gè)歷史久遠(yuǎn)的治療及預(yù)防痛風(fēng)發(fā)作的藥物，能夠抑制中性粒細(xì)胞吞噬尿酸鈉的作用，阻斷TNF-α 和IL-1β 的釋放，減少中性粒細(xì)胞流入關(guān)節(jié)腔中[22]，消除痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時(shí)的關(guān)節(jié)紅腫及炎性癥狀[23]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，緩釋微丸在體外具有穩(wěn)定的釋藥行為和速率，在體內(nèi)可緩慢穩(wěn)定的釋放藥物，血藥濃度峰谷波動(dòng)小，生物利用度及安全性可高于普通片劑[24]。我們經(jīng)過(guò)處方篩選得到致孔劑為22%，增重35%的秋水仙堿緩釋微丸，其外觀(guān)光滑圓整具有良好的形態(tài)特征，并可在體外緩慢溶出（6 h 內(nèi)溶出80%以上），具有較合適的釋放速率，可避免藥物突釋對(duì)胃腸道的刺激，同時(shí)不會(huì)因?yàn)獒尫胚^(guò)緩而影響藥效的發(fā)揮。因此，綜合以前和本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究中秋水仙堿緩釋微丸對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防效果比普通片劑更顯著可能與以上原因有關(guān)。同時(shí)，我們考察了秋水仙堿緩釋微丸在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的不良反應(yīng)，結(jié)果顯示，緩釋微丸組大鼠給藥前和給藥14 d后的攝食量無(wú)明顯變化，給藥期間體重增長(zhǎng)較正常；與片劑組比較，緩釋微丸組的攝食量及體重顯著增加（均P＜0.05），提示緩釋微丸的胃腸道不良反應(yīng)更低，與緩釋微丸組比較，片劑組腹瀉大鼠的數(shù)量增加，但可能是由于樣本數(shù)不足，兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。血清中AST、ALT的含量水平是反映肝功能的主要指標(biāo)，Cr是反映腎功能的主要指標(biāo)，肝腎受損會(huì)伴隨三者水平升高[25]。AST、ALT、Cr 試劑盒的檢測(cè)結(jié)果顯示，緩釋微丸對(duì)大鼠的肝腎功能無(wú)明顯影響，進(jìn)一步證實(shí)秋水仙堿緩釋微丸具有良好的安全性。

本實(shí)驗(yàn)中，由于不能破壞緩釋微丸的包衣層以影響緩釋效果的發(fā)揮，所以采用大鼠整體微丸灌胃的方式，操作過(guò)程中要采取比較特殊的方式和特制的灌胃針，給藥相對(duì)比較困難，而且對(duì)大鼠的食道有一定的損傷，因此采取預(yù)先給藥14 d然后造模的方式，14 d 的觀(guān)察時(shí)間略偏短，但由于劑量較大（給藥劑量在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定），因此相對(duì)于模型組效果還是比較明顯。