過表達/干擾表達miR-122對HBV穩轉優勢單克隆株HepGA14表達功能的影響*

鄭世榜，李永強，廖思娜，邱 華，廖小莉

（廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，南寧 530021）

乙型肝炎病毒（HBV）是一種噬肝DNA 病毒，可引起急性或慢性肝損傷[1]。當前，中國仍有慢性HBV感染者約7 000萬例，每年因HBV相關性肝硬化、肝癌、肝衰竭死亡的患者達30 萬人[2-3]。由于抗病毒藥物核苷（酸）類似物、干擾素尚不能清除肝細胞內的HBV 病毒復制的模板cccDNA（covalently closed circular DNA），因此，探尋治愈HBV 及相關疾病的靶點或藥物是當前研究的熱點之一。

microRNA 是一種新發現的宿主與乙肝病毒（HBV）相互作用的新機制。前期研究表明，miR-122 作為肝臟中最特異、最豐富的microRNA，參與肝臟發育、分化和穩態以及代謝功能；在調控HBV復制及HCC中發揮關鍵性作用[4]。本課題組前期成功篩選的HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩轉優勢單克隆株HepGA14能為HBV相關肝硬化和肝癌的發病機制探索、治療靶點發現和候選藥物篩選等方面提供新的研究工具[5]。基于此，為系統探索miR-122與新的HBV 體外感染與復制模型HepGA14 上HBV表達活性的關系及調控機制，本研究采用miR-122 過表達/干擾表達慢病毒質粒干預后，觀察HBVDNA、HBsAg、HBeAg 等標志物表達功能的變化，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2 細胞、293T 細胞購自上海諾百生物科技有限公司；HBV全基因組1.3倍體HBV穩轉優勢單克隆株HepGA14 細胞由課題組前期構建[5]；PDS019_pL 和PDS165_pL6.3-GFP-U6-TuD2 載 體購自上海溪照生物科技有限公司，內切酶、GeneRuler DNA Ladder、Rnase Inhibitor和T4 DNA連接酶均購自美國Thermo 公司；質粒小抽試劑盒以及凝膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；0.05%Trypsin和lipofectamine 2000 購自上海玉博生物科技有限公司；胎牛血清購自法國Biowest 公司；Opti-MEM 購自美國GIBCO 公司；引物Oligo、Trizol Reagent、熒光染料SYBR Green I、oligo dT/Random primer/特異性引物、逆轉錄酶SuperScriptIII Reverse Transcriptase、Platinum Taq DNA Polymerase、100mM dNTPs、DEPC H2O 購自美國invitrogen 公司；基因序列、引物合成、測序交由上海諾百生物科技有限公司完成；HBeAg、HBsAg 檢測試劑盒購自上海東寰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 293T 細胞、HepG2 和HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩轉優勢單克隆株HepGA14 細胞培養在含10%小牛血清的DEME培養基中。

1.2.2 miR-122 過表達載體構建 miR-122 的成熟序列來自Sanger microRNA序列數據庫（miRBase），設計miR-122 的過表達Oligo，正向引物PDS19-miR122-F：5'-CACCGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGCGAACAAACACCATTGTCACACTCCA-3'，反向引物PDS19-miR122-R：5'-AAAATGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTTCGCAAACACCATTGTCACACTCCAC-3'，酶切位點為BsmBI。以含有待擴增序列的DNA 為模板進行PCR 擴增。25 μL 反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Primer F/R 1 μL，Taq DNA polymerase 0.25 μL，（10 mmol/L）dNTPs 0.25 μL，Nuclease free water 18 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，循環：95 ℃變性20 s；67 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共35 個循環，72 ℃延長3 min，4 ℃保存。經退火后，重組至PDS019_pL 載體中，測序驗證。退火反應體系：10×Oligo Annealing Buffer 2 μL，引 物F（200 μmol/L）5 μL，引物R（200 μmol/L）5 μL，ddH2O 8 μL。退火反應條件：95 ℃5 min，72 ℃5 min，自然降溫至PCR 的Block 溫度（25 ℃）。

1.2.3 miR-122干擾載體構建 設計miR-122的干擾Oligo，正向引物PDS165-shmiR122-F：5'-CAACCAAACACCATTGTCACACTCCA-3'，反向引物PDS-165-shmiR122-R：5'-CTTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3'。正向引物酶切位點為BsmBI，反向引物酶切位點為BveI。以含有待擴增序列的DNA 為模板進行PCR 擴增。25 μL 反應體系以及PCR 反應條件同“1.2.2項”。經退火后，重組至PDS 165_pL6.3-GFP-U6-TuD2 載體中，測序驗證。退火反應體系以及退火反應條件同“1.2.2項”。

1.2.4 miR-122 過表達和干擾慢病毒包裝和滴度測定 構建好的miR-122 過表達/干擾慢病毒載體分別與包裝質粒（packaging mix）共轉染293T細胞，包裝慢病毒，收集病毒液，48 h 后測定慢病毒活性滴度。RT-qPCR 反應體系：ddH2O 6.55 μL、10×PCR buffer 1 μL、Mg2+（50 mmol/L）0.4 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL、Primer F/R（10 μmol/L）0.5 μL、Probe（FAM）（10 μmol/L）0.25 μL、Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL、Template 1 μL、Total volume 10 μL；RT-qPCR反應條件：95 ℃10 s、60 ℃30 s，40個循環。

1.2.5 miR-122 過表達和干擾慢病毒侵染HBV 1.3D-HepG2細胞及抗生素篩選

（1）慢病毒侵染HBV全基因組1.3倍體HBV穩轉優勢單克隆株HepGA14 最佳MOI 值:含8μg/mL polybrene 的完全培養液重懸靶細胞，按每孔第2 天細胞密度60%～70%的數量接種于96 孔板的各孔，設1個復孔。取出陰性對照病毒液，冰上融化，慢病毒MOI=0、2、5、10、30、60、120、240，向每孔加入病毒液。培養6 h 后，更換成完全培養液后繼續培養至24 h～96 h；熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達，明確最佳MOI，并拍攝白光和熒光視野下照片。（2）抗生素篩選:對數生長期的HepGA14細胞，以5×105/孔密度接種于12孔板;培養孔換上新配制的完全培養基+8 μg/mL ploybrene 的感染培養基，按照MOI 測定值的病毒液侵染HepGA14 細胞，培養4～6 h，更換完全培養基，繼續培養24～72 h，加入梯度為0 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL 的抗生素進行篩選;根據細胞狀態確定抗生素篩選周期，培養和凍存篩選成功的穩轉細胞系。

1.2.6 RT-qPCR 檢測miR-122 表達量 使用Hep-GA14 穩轉細胞和同樣細胞數的HepG2 細胞沉淀，抽提總RNA，逆轉錄得cDNA 放-20 ℃備用保存。采用RT-qPCR 法對miR-122 進行擴增。反應體系共25 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，正向 反向引物（10 μmol）各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 s；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s；40 個循環；添加溶解曲線。miR-122正向引物序列為：5'-ACACTCCAGCTGGGTGGAGTGTGACAATGG-3'，反向引物序列為：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 正向引物序列為：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列為：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。采用2-△△CT法進行相對表達水平定量分析。實驗重復3次。

1.2.7 RT-qPCR檢測miR-122過表達和干擾慢病毒侵染HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩轉優勢單克隆株HepGA14的miR-122表達量 miR-122過表達和干擾慢病毒分別以MOI 值=30 侵染HepGA14 穩轉細胞，48 h 后收集部分細胞，qPCR 檢測miR-122 表達水平，檢測方法同“1.2.6項”，實驗重復3次。

1.2.8 ELISA 檢測上清HBsAg 和HBeAg 水平 收集細胞上清，操作按試劑盒說明書進行，實驗重復3次。

1.2.9 RT-qPCR檢測上清HBV DNA表達量 提取細胞沉淀的總RNA，采用RT-qPCR 檢測HBV DNA的表達水平，HBV DNA 的檢測引物的正向引物為5'-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'，反向引物為：5'-CAGCAGGATGAAGAGGAA-3'，以18S rDNA 為內參，擴增引物為引物18S-F（序列5'-GAATTGACGGAAGGGCACCAC-3'）和18S-R（序 列5'-AAGAACGGCCATGCACCACCA-3'）。采用2-△△CT法進行相對表達水平定量分析，實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-122 過表達載體構建 獲得測序正確的miR-122 過表達慢病毒載體CL1044-PDS19_miR122。測序結果完全符合，無突變，表明miR-122過表達慢病毒載體構建成功，見圖1。

圖1 CL1044-PDS19_miR122 載體的測序圖譜

2.2 miR-122 干擾載體構建 獲得測序正確的miR-122 干擾慢病毒載體CL1043-PDS160_shmiR122。測序結果完全符合，無突變，表明miR-122干擾慢病毒載體構建成功，見圖2。

圖2 CL1043-PDS160_shmiR122 載體的測序圖譜

2.3 慢病毒滴度及侵染HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩轉優勢單克隆株HepGA14 細胞的MOI 測定 濃縮后的慢病毒侵染293A細胞，48 h后抽提細胞基因組。測定病毒滴度為3.24×108TU/mL。MOI=30～60時，綜合分析細胞狀態較好，陽性比例達到85%以上，符合后續實驗要求，見圖3。選取MOI=30進行后續實驗。

圖3 慢病毒侵染HepGA14 細胞的侵染效率

2.4 HepG2和HBV1.3D-HepGA14細胞miR-122表達量 HBV1.3D-HepGA14細胞來源于HepG2 并穩定含有轉染的HBV 全長基因組（ayw 亞型）。本研究使用HBV1.3D-HepGA14 細胞作為HBV 復制的模型系統，因為它能組成性表達乙型肝炎表面（HBsAg）抗原和E（HBeAg）抗原，并且還支持HBV復制，HBx、cccDNA、HBVDNA 的表達豐度更高[5]。結果發現，HBV1.3D-HepGA14 細胞（0.244±0.005）比在HepG2 細胞（1.000±0.018）中miR-122 的水平下降了70%多（t=71.467，P＜0.000 1），見圖4。表明HBV 復制和感染的存在可能導致miR-122 表達下降。

圖4 RT-PCR 檢測HBV1.3D-HepGA14 細胞中miR-122 RNA的表達情況

2.5 miR-122 過表達/干擾慢病毒侵染HBV1.3DHepGA14 細胞穩轉細胞 miR-122 過表達/干擾慢病毒侵染HepGA14 穩轉細胞可上下調miR-122 表達。與HepGA14（對照組）比較，HepGA14-VL1044（過表達組）miR-122可上調達到779倍（t=-22.878，P＜0.000 1），HepGA14-VL1043（干擾組）干擾效率可到55.03%（t=30.125，P＜0.000 1），見圖5。

圖5 miR-122 過表達/干擾慢病毒侵染HBV1.3D-HepGA14細胞穩轉細胞

2.6 過表達和干擾miR-122對HBVDNA復制、HBsAg 表達和HBeAg 表達的影響 與對照組Hep-GA14 細胞相比，過表達miR-122 后HBV DNA（t=95.925，P＜0.000 1）、HBeAg（t=92.338，P＜0.000 1）、HBsAg（t=60.706，P＜0.000 1）的表達均下降。干擾miR-122 后HBV DNA（t=-45.084，P＜0.000 1）、HBeAg（t=-22.512，P＜0.000 1）、HBsAg（t=-44.146，P＜0.000 1）的表達均上升。RT-qPCR 檢測細胞上清HBV DNA表達結果和ELISA法檢測3種細胞上清HBsAg和HBeAg表達，結果見圖6。

圖6 過表達和干擾miR-122對HBVDNA復制、HBsAg表達和HBeAg表達的影響

3 討論

目前，我國乙型肝炎病毒（簡稱乙肝）的患病率仍高于其他國家的平均水平。而臨床指南一線推薦的兩大抗病毒用藥干擾素和核苷（酸）類似物都無法干預到超螺旋結構cccDNA（HBV 基因組物質），這成為了慢性乙型肝炎難以治愈的主要原因[6]。然而，乙肝患者體內持續存在的HBV病毒，是發展為原發性肝癌（HCC）的最主要的危險因素。因此，尋找以及研究靈敏的分子標志物有助篩選早期的乙肝患者，給予合適的治療，延緩疾病的進展，是目前臨床亟待解決的關鍵問題。

乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒科，其感染人體肝臟后常引起微小RNA 表達的變化。miR-122作為肝臟獨有的含量最高的微小RNA，占肝臟微小RNA 總量的近70%[7]。其在調節肝細胞分化、增殖、凋亡以及代謝方面中起著關鍵的作用。研究發現，與健康對照組相比，HBV 感染患者肝臟中miR-122 表達顯著下調，且隨著miR-122 的表達水平下降，肝細胞內的HBV 病毒載量和壞死性炎癥會增加[8]。然而，Ji等[9]發現miR-122在HBV感染患者的血清中顯著上調，且可抑制Huh7 和HepG2 細胞中乙肝病毒的復制。因此，分析miR-122對HBV 復制作用具有重要意義，有助于提高乙肝病毒感染以及相關疾病患者的療效。

本課題組在前期已經成功篩選出HBV 全基因組1.3倍體HBV穩轉優勢單克隆株HepGA14，較傳統的HepG2.2.15 細胞株，可更加穩定、高效地表達反映HBV 的復制/感染情況的標志物：HBsAg、HBeAg、HBx、HBVDNA、cccDNA 等。本研究將構建的miR-122的過表達載體CL1044-PDS19_miR122/CL1043-PDS160_miR122干擾載體轉染優勢單克隆株HepGA14，并成功建立過表達/干擾miR-122 的HepGA14 細胞系，為研究miR-122 相關作用機制提供了良好基礎。檢測結果表明，miR-122 過表達后對HepGA14的HBsAg和HBeAg的合成和分泌產生明顯抑制作用，且顯著下調HBV DNA的滴度，而干擾miR-122后能明顯促進HepGA14細胞的HBsAg、HBeAg的表達及上調HBV DNA滴度。表明在細胞水平上miR-122 能夠調控HBV 的復制。本研究的結果與Chen等[10]團隊的研究結論相符。此外，本研究以HepG2、HBV1.3D-HepGA14為研究模型，通過檢測其miR-122 表達，證實了在乙肝病毒感染的情況下，肝細胞中miR-122 表達受到了下調。miR-122 是HCC 的重要腫瘤抑制因子，與轉移和不良預后相關[11]。Hsu 等[12]研究發現miR-122 的缺失使小鼠易患肝細胞癌。Li 等[13]發現miR-122 在HCC 中低表達，而將miR-122 過表達后會抑制肝癌細胞的侵襲、增殖和遷移能力。Wu[14]研究團隊發現，miR-122可以通過調節I型干擾素（IFN）的表達來保護肝細胞免受HBV感染。但miR-122 對HBV復制作用尚存有爭議。QIU等[15]學者發現miR-122可顯著下調HO-1的表達，間接促進HBV核心蛋白的表達，進而增強HBV復制。然而，miR-122被證明通過降低細胞周期蛋白G1 的表達來間接干擾HBV 的復制，從而導致p53 介導的HBV 轉錄受到抑制[8]。miR-122還被證實可影響核心蛋白mRNA的穩定性和翻譯，以及前基因體（pgRNA）的穩定性，從而抑制HBV基因的表達/產生[10]。因此，鑒于miR-122在肝臟中的廣泛作用，miR-122調控HBV的確切機制有待進一步研究。

目前，調節miRNA表達是輔助治療乙型肝炎以及相關疾病的一個有前景的前沿領域，可與經典抗病毒治療相結合，使患者獲得更大的收益。本實驗成功建立穩定過表達/干擾miR-122 的HBV 穩轉優勢單克隆株HepGA14細胞系，并確定miR-122在細胞水平上對HBV 復制具有一定的調控作用。但是其如何調控HBsAg、HBeAg、HBV-DNA 表達及抗HBV 機制尚未清楚，需要進一步的探索。基于目前研究結果，構建的過表達/干擾miR-122的HepGA14細胞模型能為新型抗HBV 藥物的開發提供有力的工具，具有積極的研究意義。