布比卡因通過組織蛋白酶B激活NLRP3炎性體誘導N2a細胞毒性*

余 悅，賴 堅，羅云鵬，陳美云紫，周 剛，韋麗玲，劉敬臣

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧 530021）

布比卡因作為臨床常用局麻藥被廣泛應用于椎管內(nèi)麻醉，但是研究證明其具有神經(jīng)毒性，可導致圍術期神經(jīng)并發(fā)癥[1]，一旦出現(xiàn)永久性神經(jīng)損害，將給患者造成嚴重的心理和經(jīng)濟負擔。局麻藥神經(jīng)毒性機制尚未明確，仍缺乏有效的防治措施，因此闡明其神經(jīng)毒性機制及探討有效調(diào)控靶點是臨床急需解決的問題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，布比卡因通過激活NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）炎性體導致細胞焦亡從而誘導小鼠腦神經(jīng)瘤細胞（Neuro-2a，N2a）毒性[2]，然而，布比卡因如何激活NLRP3 炎性體仍需進一步探索。有研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B（Cathepsin B,CTSB）與NLRP3 炎性體及焦亡途徑密切相關[3]。CTSB 是溶酶體中重要的一種半胱氨酸蛋白水解酶，當危險因素導致溶酶體膜通透性改變時，CTSB 從溶酶體釋放至細胞質，觸發(fā)一系列細胞損傷通路[4]。Chen等[3]研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇腦損傷細胞模型中，27-羥基膽固醇可以誘導SH-SY5Y細胞CTSB釋放，導致NLRP3炎性體活化誘導細胞焦亡。而Li等[5]的研究發(fā)現(xiàn)布比卡因引起的肌毒性模型中自噬及溶酶體酶CTSB活性增加。CTSB是否參與布比卡因誘導的NLRP3炎性體活化導致神經(jīng)細胞毒性尚未有相關報道。因此，本研究擬在布比卡因誘導的N2a 神經(jīng)細胞損傷模型中，探討CTSB 對NLRP3 炎性體活化的影響，進一步探索布比卡因神經(jīng)毒性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

小鼠腦神經(jīng)瘤細胞（Neuro-2a，N2a）（中國科學院上海細胞庫）；MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司）；布比卡因粉劑（美國Sigma公司）；CA-074-me（美 國MCE 公司）；CCK-8 試劑盒（日 本Dojindo公司）；乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒（中國碧云天公司）；CTSB 抗體（中國萬類生物）；NLRP3 抗體、cleaved-caspase-1 抗體、N-GSDMD 抗體（美國Novus公司）；GAPDH抗體（美國proteintech公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 N2a細胞用含有10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2清潔培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d 更換新鮮培養(yǎng)基。當細胞生長密度達80%以上，用0.25%胰酶進行消化、傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期N2a 細胞隨機分為4 組，空白對照組（C組）：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，無任何藥物干預；單純組織蛋白酶B（CTSB）抑制劑組（CA 組）：10 μmol/L 的CA-074-me 預處理1 h 后不加任何藥物處理；CTSB抑制劑預處理+布比卡因組（CA+B 組）：10 μmol/L的CA-074-me 預處理1 h 后，采用0.9 mmol/L 的布比卡因培養(yǎng)12 h；布比卡因組（B組）：0.9 mmol/L的布比卡因培養(yǎng)12 h。

1.2.2 CCK-8 法測定各組細胞活力 細胞以5×103個/孔的密度接種96孔板，按“1.2.1項”分組，每組設3個平行孔，到達藥物處理時間后，用基礎培養(yǎng)基配制10%的CCK-8 工作液，每孔更換CCK-8 工作液100 μL，避光孵育2 h。用酶標儀避光檢測在450 nm波長處的吸光度（OD 值），以細胞存活率表示細胞活力。細胞存活率（%）=（各組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。每次實驗至少重復3次，取平均值，下同。

1.2.3 LDH 釋放實驗檢測各組細胞上清液LDH 活性 按“1.2.2項”方法培養(yǎng)細胞，到預定檢測時間將細胞培養(yǎng)板用400 g 離心5 min，分別取各孔上清液120 μL，加入到新的96 孔板中，再分別加入60 μL LDH 檢測工作液混勻，室溫避光孵育30 min 后在490 nm處測定吸光度，吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關，根據(jù)各組細胞上清液中OD 值反映LDH活力，由此判斷細胞膜損傷程度。

1.2.4 免疫熒光法檢測NLPR3 蛋白表達量 細胞以2×105個/孔的密度培養(yǎng)于置有細胞爬片的12 孔板，分組干預。到達藥物孵育時間后，PBS 潤洗3 次，加入4%多聚甲醛室溫下固定15 min，用0.5%Trion-X-100 通透20 min，5%山羊血清室溫下封閉30 min，每孔加入NLRP3 一抗（稀釋比例1∶50）150 μL 4 ℃過夜。第2天用PBS潤洗3次，每孔加入熒光二抗（稀釋比例1∶1 000）150 μL，室溫避光孵育1 h。PBS潤洗后加DAPI復染核5 min。取出爬片，倒置于加入抗熒光淬滅劑的載玻片中，于熒光顯微鏡下觀察，以Image J 測定各組平均熒光強度，并進行半定量分析。

1.2.5 Western blotting檢測CTSB、NLRP3、cleavedcaspase-1、N-GSDMD 蛋白表達 將RIPA 裂解液加入各組干預好的細胞中，冰上裂解30 min，以4 ℃，12 000 r/min 離心15 min，取上清用BCA 法進行蛋白定量。加入蛋白上樣緩沖液混勻煮沸5 min 變性。每組取30 μg 蛋白在SDS-PAGE 膠上進行電泳，經(jīng)濕轉法將蛋白轉移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（CTSB、NLRP3、cleaved-caspase-1、N-GSDMD，稀釋比例均1∶500）和GAPDH（稀釋比例1：10 000）4 ℃搖床孵育過夜；用TBST洗膜，加入熒光標記的二抗（1∶10 000），室溫搖床孵育1 h，洗膜。用Image J軟件測定灰度值，以目的條帶與GAPDH為內(nèi)參條帶灰度值的比值來反映蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞活力的比較

與C組比較，CA組細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），B 組和CA+B 組細胞存活率均明顯降低（P＜0.05）；與B 組比較，CA+B 組細胞存活率明顯升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組細胞活力的比較

2.2 各組細胞上清液LDH活性的比較

與C組比較，CA組上清液LDH活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CA+B組和B組細胞LDH活性均明顯增加（均P＜0.05）；與B 組比較，CA+B組LDH活性明顯減少（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組細胞上清液LDH活性的比較

2.3 各組細胞NLRP3蛋白免疫熒光相對表達變化

與C組比較，CA組NLRP3熒光強度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CA+B組和B組NLRP3熒光強度均明顯增強（均P＜0.05）；與B組比較，CA+B組NLRP3熒光強度明顯減弱（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細胞NLRP3蛋白免疫熒光相對表達變化

2.4 各組細胞CTSB 蛋白及NLRP3 炎性體活化相關蛋白NLRP3、N-GSDMD、cleaved-caspase-1 表達情況

與C組相比，CA組CTSB、NLRP3、N-GSDMD、cleaved-caspase-1蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），B組上述蛋白表達均明顯升高（P＜0.01）；與B組比較，CA+B組以上蛋白表達均明顯下調(diào)（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細胞蛋白相對表達水平

3 討論

布比卡因是臨床常用酰胺類長效局麻藥，其引起的神經(jīng)毒性已成為臨床麻醉醫(yī)生關注的焦點。局麻藥神經(jīng)毒性目前尚無行之有效的防治方法，若出現(xiàn)早期神經(jīng)損害癥狀，臨床上常以小劑量的糖皮質激素抗炎、維生素B12營養(yǎng)神經(jīng)、高壓氧等對癥支持治療為主[6-7]。眾所周知，全身應用糖皮質激素可導致消化性潰瘍、血糖升高等不良反應[8]，盡管Zhong 等[9]報道局部使用地塞米松可促進神經(jīng)損傷后修復，但是也有研究表明局部應用地塞米松會暫時性減少神經(jīng)血流，進一步加重損傷[10]。因此，需要進一步尋找有效的防治局麻藥神經(jīng)毒性的調(diào)控靶點。以往研究發(fā)現(xiàn)布比卡因所致的神經(jīng)毒性涉及多種因素及調(diào)控機制，包括氧化應激、內(nèi)質網(wǎng)應激介導的凋亡[11]，自噬[12]，Parthanatos 等[13]程序性細胞死亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)細胞焦亡也參與其中，NLRP3 炎性體活化導致的細胞焦亡途徑是布比卡因誘導N2a 細胞毒性的重要機制[2]，但是布比卡因活化NLRP3炎性體的具體機制尚未闡明。

炎性體是由模式識別受體（pattern recognition receptors,PRRs）、含CARD 結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD，ASC）和pro-caspase-1 組成的多蛋白復合體[14]。經(jīng)典細胞焦亡途徑的激活主要依賴于炎性體組裝形成，激活pro-caspase-1 成為有活性的caspase-1，進一步切割下游GSDMD 目的蛋白，GSDMD的N末端在細胞膜上定位聚集成孔，細胞滲透壓改變，逐漸腫脹至質膜破裂[15]。本研究結果顯示，布比卡因處理N2a細胞12 h后，細胞活力明顯下降，細胞上清液LDH 釋放增多，提示布比卡因可引起N2a細胞損傷，細胞膜完整性破壞；免疫熒光結果顯示，NLRP3蛋白表達顯著增加，western blotting結果也顯示，NLRP3 炎癥體活化相關蛋白NLRP3、cleaved-caspase-1和N-GSDMD顯著升高，表明布比卡因可能通過激活NLRP3 炎性體及焦亡相關分子誘導N2a神經(jīng)細胞毒性，與前期的研究結果一致[2]。

大量研究表明，炎性體的活化參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，包括顱腦感染、創(chuàng)傷性腦損傷、缺血性腦卒中、神經(jīng)退行性疾病等，抑制炎性體活化可減輕組織損傷[3,16-18]。Liu 等[17]的研究表明，TBI 24 h 后，NLRP3 基因敲除小鼠腦組織損傷程度和認知功能皆優(yōu)于野生型（WT）組。此外，多種非神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生也與NLRP3的活化密切相關，例如痛風、癌癥、動脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病等[18]。因此，人們對其激活機制進行廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)了多種激活模型，包括溶酶體不穩(wěn)定[19]、活性氧的過量產(chǎn)生[20]、鉀離子外流[21]、線粒體DNA 的釋放[22]等。CTSB 是溶酶體內(nèi)重要的組織蛋白酶，溶酶體受損后，溶酶體膜通透性增強，溶酶體酶包括CTSB的釋放，會引起一系列細胞反應[4]。研究發(fā)現(xiàn)，CTSB誘導細胞凋亡，抑制人神經(jīng)母細胞瘤細胞SHSY5Y細胞生長[23]。Orlowski等[24]的研究表明，由于溶酶體膜通透性改變，釋放到細胞質中的CTSB 激活炎癥體誘導細胞焦亡，導致原代小鼠巨噬細胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，B組布比卡因處理N2a 細胞12 h 后，CTSB 蛋白表達量顯著上升，說明CTSB參與了布比卡因引起的N2a神經(jīng)細胞毒性機制。為了證實CTSB 在布比卡因激活NLRP3 炎性體中的作用，本課題組應用CTSB 抑制劑CA-074-me對細胞進行預處理，抑制CTSB的活性。結果發(fā)現(xiàn)，與布比卡因組比較，CTSB 抑制劑預處理+布比卡因組的CTSB 蛋白表達量下調(diào)，同時細胞活性得以改善，LDH釋放減少，說明CTSB抑制劑預處理減輕布比卡因對細胞損傷的作用。同時，免疫熒光結果顯示NLRP3 蛋白表達減少，western blotting 結果也顯示NLRP3 炎性體活化相關蛋白NLRP3、cleaved-caspase-1和N-GSDMD表達明顯降低，提示CTSB 通過激活NLRP3 炎性體參與布比卡因誘導N2a神經(jīng)細胞毒性機制，CTSB可能是布比卡因神經(jīng)毒性機制有效的調(diào)控靶點。

綜上所述，布比卡因可通過誘導Cathepsin B激活NLRP3炎性體導致N2a神經(jīng)細胞毒性，為臨床防治布比卡因神經(jīng)毒性提供了新思路。