白楊素對7-酮基膽固醇誘導的巨噬細胞炎癥及脂代謝紊亂的影響*

胡子旋，蔡大可，李鈺婷，賴亦靜，甘海寧，姚 楠，黃丹娥，黃雪君，陳玉興

（1.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣州 510095；2.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣州 510095；3.廣東廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣州 510405）

動脈粥樣硬化（AS）導致的心血管疾病在全球范圍內有較高的發病率和死亡率，經常引起中風、心肌梗死，甚至猝死等。脂質代謝失調和不良免疫反應是引起AS 的主要原因[1]。這一過程中血管內皮損傷導致氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL）皮下聚集引起慢性炎癥反應，脂蛋白長期沉積在動脈中，巨噬細胞未能清除多余的膽固醇而轉化為載脂的泡沫樣細胞，泡沫細胞是AS 病變的一個標志[2-3]。由此可見，ox-LDL 誘導巨噬細胞的炎癥激活和發生，從而促進AS 的形成，但ox-LDL 在巨噬細胞中誘導炎癥激活和炎癥發生的確切機制尚不完全清楚。7-酮基-膽固醇（7-keto-cholesterol,7-KC）是ox-LDL中干擾巨噬細胞脂質代謝的主要成分，同時易引起內皮損傷促進炎癥反應，常被用于誘導炎癥表型和高脂負荷的巨噬細胞[4-5]。白楊素廣泛存在于蜂蜜、蜂膠和天然植物提取物中，并發揮抗炎、抗氧化等藥理活性[6]。有報道稱，白楊素可降低裸鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α 和甘油三脂水平，具有急性降血脂作用[7]。此外，在飲食誘導形成的大鼠AS 模型中，白楊素能降低血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平，在慢性環境下表現出抗AS的潛能[8]，成為預防和治療AS 很有希望的候選藥物，但其對炎癥反應和膽固醇代謝調節的分子機制仍需進一步探索。因此，本研究采用7-KC造模，模擬AS 發病過程中氧化膽固醇致病原理，探究白楊素對7-KC所致巨噬細胞產生炎癥和脂質代謝紊亂的干預作用，并探討其發揮抗炎調脂作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 儀器 多功能酶標儀（ThermoFisher）；細胞培養箱（ThermoFisher）；CKX41型倒置顯微鏡（奧林巴斯）；IQ5 熒光定量PCR 儀（ThermoFisher）；Power-Pac Basic 電泳儀（Bio-Rad）；濕轉轉模儀（Gen-Script）；Tanon 5200 Multi 多功能成像系統（上海天能）。

1.2 材料來源 純度為98.5%的白楊素（BW5648）購自北京壇墨質檢科技有限公司；瑞舒伐他汀（44180518）購自魯南貝特制藥有限公司；7-KC（CY18951）購自上海凱梅根生物公司；MEM-alpha高糖培養基（8119219）、青-鏈霉素（2185224）、胰蛋白酶（2186960）購自美國Gibco 公司；胎牛血清（1909A）購自澳大利亞Bovogen 公司；噻唑藍（MTT）（JT343）購自北京鼎國昌盛有限公司；RNAev 試劑（A1A1039）購自湖南艾科瑞生物有限公司；RIPA裂解液（20200928）購自北京索萊寶有限公司；二甲基亞砜（DMSO）（EB26BA0032）購自上海生工生物工程有限公司；實時熒光定量PCR（RTqPCR）試劑盒（1909670A）購自日本Takara 公司；一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒（S0021）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（RB230506）購自上海碧云天生物技術有限公司；一抗actin（ab8227）、SR-B1（ab217318）、P65（ab86299）、iNOS（ab3523）和二抗Rb（ab97051）、Ms（ab97023）購自艾博抗貿易有限公司。

1.3 細胞培養與分組 RAW264.7細胞株購自上海中科院細胞庫。RAW264.7細胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中，于含有10%胎牛血清與1%青—鏈霉素的MEM-alpha 培養基中培養。取對數生長期的細胞進行細胞分組，空白組只加MEM-alpha 培養基，模型組加入含2 μg/mL 7-KC的MEM-alpha培養基，瑞舒伐他汀組加入含2 μg/mL 7-KC 和1 μmol/L瑞舒伐他汀的MEM-alpha培養基，白楊素高劑量組加入含2 μg/mL 7-KC 和5 μmol/L 白楊素的MEMalpha培養基，白楊素中劑量組加入含2 μg/mL 7-KC和1 μmol/L白楊素的MEM-alpha培養基，白楊素低劑量組加入含2 μg/mL 7-KC 和0.1 μmol/L 白楊素的MEM-alpha 培養基，每組3 個平行孔。待細胞貼壁生長24 h后收集細胞及上清液。

1.4 MTT法細胞活性檢測 楊素純度為98.5%，摩爾質量為254.24，稱取9.6 mg 的白楊素溶于185 μL DMSO 溶液，配成200 μmol/L 的白楊素溶液。調節RAW264.7 細胞濃度為104/mL 孔接種于96 孔板，用不同濃度白楊素（0 μmol/L、1.56 μmol/L、3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L）孵育細胞24 h后，每孔加入20 μL MTT 染料處理12 h，然后與150 μL DMSO 混合培養5 min，用酶標儀檢測在570 nm波長下各孔的OD值，計算存活率。

1.5 NO含量檢測 細胞給藥處理24 h后收集上清液，根據NO試劑盒說明書步驟操作，用多功能酶標儀在540 nm 波長下檢測OD 值，做標準曲線，計算NO的含量。

1.6 RT-qPCR 法檢測相關基因mRNA 的表達 細胞給藥處理24 h后棄去上清，RNAev試劑處理細胞樣品，提取總RNA，按照TaKaRa公司PCR試劑盒說明書操作逆轉錄獲得cDNA，使用TB Green 法加入引物，以94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；5 ℃，30 s；72 ℃，50 s（45 個循環）；72 ℃，7 min 進行擴增，采用2-ΔΔCT法計算基因表達量。基因引物由上海英濰捷基公司合成，引物信息見表1。

表1 擴增的基因引物信息

1.7 Western blotting 檢測相關蛋白的表達 細胞給藥處理24 h后棄去上清，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度后，95 ℃下使蛋白煮沸變性。取等量總蛋白通過電泳轉膜過程分離蛋白并轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，孵育一抗（NF-κB P65 1∶1 000、SR-B1 1∶2 000、iNOS 1∶500）過夜，洗滌，孵育二抗（兔抗1∶10 000），洗滌，自動成像系統曝光顯影后進行半定量檢測分析。

1.8 統計學方法 所有數據使用IBM SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Dunnett T3 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT 法檢測RAW264.7 細胞存活率 隨著白楊素濃度的增加，細胞存活率逐漸下降；0～6.25 μmol/L 白楊素濃度范圍內，RAW264.7 細胞存活率大于90%，與空白組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。因而在該范圍內選取5 μmol/L、1 μmol/L和0.1 μmol/L濃度進行藥物機制研究。

圖1 白楊素對RAW264.7細胞存活率的影響

2.2 白楊素對RAW264.7細胞NO分泌的影響 與空白組相比，模型組上清液中NO 分泌量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，白楊素高、中、低劑量組NO 分泌量均顯著降低（均P＜0.05），見表2。提示白楊素可抑制7-KC 誘導的RAW264.7 細胞分泌NO。

表2 白楊素對RAW264.7細胞NO分泌的影響 μmol/L，，n=3

表2 白楊素對RAW264.7細胞NO分泌的影響 μmol/L，，n=3

與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

2.3 白楊素調控RAW264.7 細胞炎癥及脂代謝相關基因的表達 與空白組相比，模型組中ABCG1、LXRα、IL-17A、IL-10的mRNA表達顯著降低（均P＜0.05），IL-6、Mcp-1的mRNA 表達顯著升高（均P＜0.05）。與模型組相比，白楊素高劑量組中ABCG1、LXRα、IL-17A、IL-10表達顯著上調（均P＜0.05），IL-6表達顯著下調（P＜0.05）；白楊素中劑量組中LXRα、IL-17A、IL-10表達顯著上調（均P＜0.05），IL-6、Mcp-1表達顯著下調（均P＜0.05）；白楊素低劑量組中IL-10表達顯著上調（P＜0.01），見圖2。

圖2 白楊素調控RAW264.7細胞炎癥及脂代謝相關基因的表達

2.4 白楊素調控RAW264.7 細胞炎癥及脂代謝相關蛋白的表達 與空白組相比，模型組NF-κB P65、iNOS 蛋白表達量顯著升高（均P＜0.05），SR-B1 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，白楊素高劑量組NF-κB P65 蛋白表達量顯著降低（P＜0.01），SR-B1 表達量明顯升高（P＜0.01）；白楊素中、低劑量組NF-κB P65、iNOS 蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 白楊素調控RAW264.7細胞炎癥及脂代謝相關蛋白的表達

3 討論

脂代謝紊亂及炎癥反應是AS的兩個關鍵致病因素，其中炎癥能夠進一步觸發脂質代謝紊亂，是導致現有調血脂藥物對AS 治療并不理想的原因。因此，抑制炎癥為抗AS 藥物研發提供新的思考和策略。在AS 發展過程中，膽固醇逆向轉運機制（RCT）是機體清除血液中過剩膽固醇的重要途徑[9]。研究顯示，三磷酸腺苷結合盒轉運酶Abcg1和清道夫受體SR-B1 參與調控RCT 過程所發揮的重要作用，Abcg1 可作為RCT 的關鍵限速酶，促進粥樣斑塊中的膽固醇轉移至巨噬細胞內，并通過肝臟代謝成膽汁酸排出體外[10]；SR-B1 可選擇性結合ox-LDL 進入巨噬細胞吞噬清除，促進膽固醇外流[11]。據報道核受體超家族成員肝X 受體LXR 被激活后可作用于Abcg1、SR-B1，PPRAg/LXRα-Abcg1通路上調能降低小鼠血清ox-LDL水平[12]；而在小鼠肝臟中，LXRα可與SR-B1基因啟動子結合，調控SR-B1的轉錄活性[13]。本研究結果顯示，7-KC導致巨噬細胞中Abcg1 和SR-B1 的表達水平下降（P＜0.05），推測7-KC 可能通過調控脂代謝轉運酶的表達從而影響RCT，而白楊素能逆轉7-KC 誘導的Abcg1的mRNA 和SR-B1 的蛋白表達抑制，調節7-KC 所致的脂質代謝紊亂。同時，白楊素能上調LXRα的mRNA表達水平（P＜0.05），提示白楊素調節脂質代謝的作用靶點可能與其上游的PPRAs/LXRα通路有關。但是確切的LXR調控作用仍需后續深入的研究來證實。

高膽固醇血癥可增加ox-LDL 的浸潤和滯留，從而通過釋放促炎因子激活內皮細胞和炎性細胞引起慢性炎癥[14]。已有的研究表明，炎癥基因的誘導表達是通過多重分子機制介導產生，如MAPK信號轉導通路、PI3K-Akt 通路和NF-κB 調控通路[4,15]。其中NF-κB可被血管內炎癥反應激活，并作為關鍵的轉錄因子調控各種炎癥介質如NO、IL-1β、IL-6等[16]。本實驗中，7-KC導致巨噬細胞的炎癥信號通路級聯反應，即NF-κB的激活以及下游一氧化氮合酶iNOS 的轉錄、翻譯以及外排水平的誘導性表達。白楊素干預后，iNOS的蛋白表達降低從而使細胞外NO 的分泌下調，且白楊素干預后巨噬細胞趨化因子MCP-1、促炎因子IL-6 mRNA 表達下降，調節因子IL-10、IL-17A表達水平上升，表明白楊素具有明顯抗炎活性。iNOS 和促炎因子作為NF-κB 通路下游的靶蛋白和靶基因，其轉錄翻譯受到NF-κB的調控，提示白楊素的抗炎分子機制可能與NF-κB通路有關。由于NF-κB常以P50/P65二聚體形式存在，且P65具有增強調控基因轉錄活性的作用[17]，本實驗檢測了NF-κB P65蛋白的表達。本研究結果顯示，7-KC 刺激了P65 蛋白表達，白楊素處理后可顯著降低P65 蛋白水平，并呈現劑量依賴性的抑制NF-κB的激活（P＜0.05），提示白楊素可能通過抑制NF-κB調控的炎癥通路緩解AS的發展。

綜上，白楊素可能通過調控NF-κB通路來發揮調脂抗炎功能，其靶點可能為NF-κB與LXR相互作用的關鍵蛋白HDAC、STAT3等，這些蛋白的調控可能成為調血脂潛在新靶點。鑒于白楊素的特點及本實驗研究的發現，以HDAC、STAT3為分子靶標篩選的策略，為優化白楊素調血脂藥效和抗炎提供依據，從而進一步提高其對AS疾病的療效。