銀杏葉提取物注射液對糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面恢復的作用及機制研究*

何豐來，肖 聰，龍能吉，劉利娟

（四川省綿陽市第三人民醫(yī)院 四川省精神衛(wèi)生中心骨科，綿陽 621000）

糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者常見的嚴重并發(fā)癥，約有四分之一的糖尿病患者會并發(fā)糖尿病足。DFU 增加了糖尿病患者下肢截肢和死亡風險[1]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給社會和患者家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔[2-3]。如何促進DFU 創(chuàng)面愈合，避免傷口反復感染，從而降低局部組織缺血壞死甚至致殘，是目前亟待解決的醫(yī)學難題。

銀杏葉提取物注射液具有化淤阻、活氣血、通脈絡(luò)等功效，其主要成分為黃酮苷、銀杏葉多糖、銀杏葉黃酮，還有部分銀杏苦內(nèi)脂，銀杏內(nèi)脂A、B、C等活性成分[4-5]，具有清除自由基、拮抗血小板活化因子及影響神經(jīng)介質(zhì)等作用[6]，在治療冠心病、心絞痛、腦血管痙攣方面有著廣泛的應(yīng)用。有研究顯示，Wnt/β-catenin 信號通路的抑制是糖尿病足發(fā)生的重要機制[7]。在骨質(zhì)疏松、肺癌血管生成以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面，銀杏葉提取物對Wnt/β-catenin通路有調(diào)控作用[8-10]，但其對糖尿病足的作用鮮少報道。本研究旨在觀察銀杏葉提取物注射液對DFU大鼠及普通潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合的作用及其機制，并比較不同注射方式的效果，為其作為新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 48 只健康雄性SD 大鼠，體重150～200 g，由四川大學華西醫(yī)院科技園區(qū)科研基地提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030，動物使用許可證號：SYXK（川）2018-119。所有動物飼養(yǎng)于溫度21～25 ℃，濕度40%～60%，12 h/12 h明暗交替的清潔級動物房內(nèi)，自由攝食、飲水。實驗嚴格遵守動物實驗中的3R原則。

1.2 藥物和主要試劑 銀杏葉提取物注射液購自悅康藥業(yè)集團有限公司。鏈脲佐菌素（STZ）購自索萊寶公司。腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-8、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購于美國Abcam 公司。兔抗鼠Wnt1 多克隆抗體、兔抗鼠Wnt3α多克隆抗體、兔抗鼠β-catenin單克隆抗體、兔抗鼠單克隆CD34 抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗均購于美國Abcam公司。

1.3 實驗分組和給藥 將48只大鼠隨機分為6組，分別為普通潰瘍組、普通潰瘍+術(shù)前術(shù)后注射組、普通潰瘍+術(shù)后注射組、DFU 組、DFU+術(shù)前術(shù)后注射組、DFU+術(shù)后注射組，每組8只。DFU 組、DFU+術(shù)前術(shù)后注射組、DFU+術(shù)后注射組建立DFU 大鼠模型，普通潰瘍組、普通潰瘍+術(shù)前術(shù)后注射組、普通潰瘍+術(shù)后注射組不進行糖尿病誘導，僅在相同位置行皮膚切除制作潰瘍創(chuàng)面。

普通潰瘍組和DFU 組創(chuàng)面基底部不注射銀杏葉提取物注射液，僅給予等量生理鹽水。普通潰瘍/DFU+術(shù)前術(shù)后注射組從術(shù)前2 d開始，在手術(shù)創(chuàng)面基底部局部注射銀杏葉提取物注射液90μL[11]，1次/d，持續(xù)注射至術(shù)后21 d；普通潰瘍/DFU+術(shù)后注射組術(shù)后在手術(shù)創(chuàng)面基底部注射銀杏葉提取物注射液90μL，1次/d，持續(xù)注射21 d。

1.4 DFU 大鼠模型的建立 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 周，禁食24 h 后腹腔注射40 mg/kg 以檸檬酸緩沖液配制的1%STZ溶液，隔天注射，共注射3次，建立糖尿病模型。血糖高于16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲多尿，背毛污穢，墊料潮濕，表示糖尿病模型制備成功。糖尿病模型制備后各組大鼠均改為普通飼料飼養(yǎng)。成模2周后，用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，于足背部消毒后，除毛。生理鹽水清洗后暴露皮膚，術(shù)區(qū)碘伏消毒，75%乙醇脫碘。使用直徑8 mm的活檢穿孔器標記，以手術(shù)剪沿標記制作全層皮膚開放性缺損創(chuàng)面，面積約為1.0 cm×1.0 cm[12]。徹底止血、消毒，全程保持自然暴露[13]。普通潰瘍組大鼠不進行糖尿病誘導，僅在相同位置行皮膚損傷。

1.5 創(chuàng)面形態(tài)觀察及愈合率檢測 記錄各組術(shù)后1周、2周、3周大鼠創(chuàng)面恢復情況，以完全被上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合依據(jù)。采用Image-Plus 6.0 圖像分析軟件測定潰瘍創(chuàng)面面積，每周計算愈合率。創(chuàng)面愈合率=[（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積]×100%。

1.6 免疫組化計數(shù)組織創(chuàng)面微血管密度（MVD）[14]創(chuàng)口形成21 d 后，用4%戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，取創(chuàng)面邊緣組織標本，中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水后，3%H2O2浸泡10 min，清水洗2次，檸檬酸緩沖液煮沸2次；緩沖液清洗2次后山羊血清封閉，加入鼠抗單克隆CD34 抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔二抗，顯色劑顯色，蘇木精中復染。脫水后二甲苯浸泡封片晾干，顯微鏡下觀察CD34表達情況，拍照。用CD34蛋白作為標記計數(shù)MVD，反映新血管生成程度。CD34標記MVD的判定方法：20倍（物鏡）視野下計數(shù)血管直徑＜20 μm，與周圍細胞分界清楚即為一個新生血管，MVD 為每個視野下的血管數(shù)。

1.7 創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD檢測 創(chuàng)口形成21 d 后，將大鼠麻醉后處死，取創(chuàng)面組織樣本稱重，4 ℃下研磨制成5%組織勻漿，冰上靜置10 min 后，3 500 r/min 離心15 min，吸取上清液，采用ELISA 法檢測創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD含量。

1.8 Western blotting 法檢測Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白表達 創(chuàng)口形成21 d后處死動物，取潰瘍面?zhèn)诮M織。使用RIPA裂解液在冰上提取組織總蛋白，蛋白定量；10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST洗膜5 min，重復3 次，分別加入一抗Wnt1、Wnt3a、β-catenin及β-actin（均1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min，重復3 次；加入相應(yīng)HRP 標記二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h。TBST 洗膜5 min，重復3 次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J 軟件計算條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 隨著時間延長，各組大鼠創(chuàng)面愈合率均升高。術(shù)后1 周、2 周，與普通潰瘍組/DFU組比較，普通潰瘍/DFU+術(shù)前術(shù)后注射組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯升高（均P＜0.05）；術(shù)后1周、3 周，DFU 組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯低于普通潰瘍組（P＜0.05）；術(shù)后2 周，與DFU+術(shù)后注射組比較，DFU+術(shù)前術(shù)后注射組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯升高（P＜0.05）；術(shù)后3周，除DFU組外，其他各組大鼠創(chuàng)面愈合率均為99%以上，見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 %，

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 %，

與普通潰瘍組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DFU組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與DFU+術(shù)后注射組比較，△P＜0.05。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面組織MVD比較 大鼠創(chuàng)面組織CD34免疫組化染色結(jié)果顯示：與普通潰瘍組比較，普通潰瘍+術(shù)前術(shù)后注射組CD34陽性表達升高，即MVD 增加，DFU 組和DFU+術(shù)后注射組CD34 陽性表達降低，即MVD 減少（均P＜0.05）；與DFU 組比較，DFU+術(shù)前術(shù)后注射組CD34 陽性表達升高，即MVD 增加（P＜0.01），與普通潰瘍/DFU+術(shù)后注射組比較，普通潰瘍/DFU+術(shù)前術(shù)后注射組CD34 陽性表達升高，即MVD增加（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織CD34染色情況（×400）及創(chuàng)面組織MVD比較

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD 水平比較 普通潰瘍組、普通潰瘍+術(shù)前術(shù)后注射組、普通潰瘍+術(shù)后注射組創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與普通潰瘍組比較，DFU組TNF-α、IL-6、IL-8、MDA 水平升高，SOD 水平降低（P＜0.01）；與DFU組比較，DFU+術(shù)前術(shù)后注射組創(chuàng)面SOD水平升高，TNF-α、IL-6、IL-8、MDA 水平降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面MDA、SOD水平比較

表2 各組大鼠創(chuàng)面MDA、SOD水平比較

與普通潰瘍組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DFU組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.4 各組大鼠創(chuàng)面Wnt/β-catenin 通路蛋白表達比較 創(chuàng)面形成后21 d，與普通潰瘍組比較，普通潰瘍+術(shù)前術(shù)后注射組Wnt1蛋白表達量升高，DFU組Wnt1、Wnt3α和β-catenin蛋白表達量降低，DFU+術(shù)后注射組Wnt1和β-catenin蛋白表達量降低（均P＜0.05）；與DFU組比較，DFU+術(shù)前術(shù)后注射組Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表達量升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠創(chuàng)面Wnt/β-catenin通路蛋白表達量比較

3 討論

由于周圍神經(jīng)病變導致感覺減退以及肢體血管病變?nèi)毖瑢е绿悄虿』颊呔植扛腥拘纬商悄虿∽?。治療方案主要包括清?chuàng)及促進愈合[15-16]。糖尿病患者中，90%屬于2型糖尿病[17]，因此，本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合STZ誘導的方法，建立了更接近于臨床的2型糖尿病大鼠模型。糖尿病患者皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，創(chuàng)傷發(fā)生后，持續(xù)性炎性因子浸潤導致細胞外基質(zhì)沉積。本研究采用銀杏葉提取物注射液對創(chuàng)面組織進行干預，發(fā)現(xiàn)普通潰瘍組大鼠創(chuàng)面愈合率高于DFU組，且術(shù)前術(shù)后注射組大鼠創(chuàng)口愈合率高于術(shù)后注射組大鼠。在創(chuàng)口形成后2周內(nèi)，DFU+術(shù)前術(shù)后注射組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著低于DFU 組，但在術(shù)后3 周時，其創(chuàng)口愈合率接近100%。說明術(shù)前及術(shù)后注射對于DFU創(chuàng)口的治療效果達到正常組織水平。

愈合創(chuàng)面受損還與血管生成減少和異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[18-19]。CD34 蛋白廣泛分布于毛細血管內(nèi)皮細胞，在成熟血管內(nèi)皮中的表達很低，因此，采用CD34 作為表面標記來計數(shù)MVD，具有較高的特異性、敏感性和可重復性，可反映新血管的生成程度[20]。本研究采用免疫組化方法檢測大鼠創(chuàng)面CD34蛋白表達，發(fā)現(xiàn)DFU組大鼠創(chuàng)面組織CD34蛋白表達量顯著低于普通潰瘍組（P＜0.05），這與DFU 大鼠潰瘍部位血管生成減少的研究[21]結(jié)果一致。且DFU大鼠術(shù)前、術(shù)后均給予銀杏葉提取物注射液后，其CD34 蛋白表達高于僅術(shù)后注射的大鼠及未注射的大鼠。表明術(shù)前及術(shù)后注射銀杏葉提取物注射液可增加DFU大鼠創(chuàng)面微血管生成，從而促進創(chuàng)口愈合。

IL-6和IL-8是人體重要的免疫細胞因子，TNFα 是由單核巨噬細胞分泌的促炎因子[22]，與機體炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)[23-24]。本研究中，DFU 組大鼠創(chuàng)面組織IL-6、IL-8 和TNF-α 水平顯著高于普通潰瘍組（P＜0.05），而術(shù)前、術(shù)后注射銀杏葉提取物注射液處理后，DFU 大鼠創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6 和IL-8含量降低，但仍高于普通潰瘍組，提示糖尿病足大鼠創(chuàng)面炎癥反應(yīng)未能達到健康大鼠水平，但銀杏葉提取物注射液局部注射可以抑制糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng)，控制傷口感染，從而可能減少糖尿病足截肢的發(fā)生[25]。

2 型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展涉及到多種機制[26]。除了糖脂代謝失調(diào)以外，免疫損傷和氧化應(yīng)激也是2型糖尿病周圍神經(jīng)病變的原因之一[27]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平升高提示體內(nèi)存在活性氧聚集，機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而SOD 是體內(nèi)抵御氧化應(yīng)激重要的抗氧化劑，與機體的抗氧化能力密切相關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，DFU 組大鼠創(chuàng)面組織MDA水平顯著高于普通潰瘍組大鼠，SOD水平顯著低于普通潰瘍組大鼠；且術(shù)前、術(shù)后給予銀杏葉提取物注射液后，大鼠創(chuàng)面組織SOD 水平顯著升高（P＜0.05）。提示DFU 大鼠創(chuàng)面組織應(yīng)激水平高于普通潰瘍大鼠，銀杏葉提取物可顯著提高DFU大鼠的抗氧化能力，改善創(chuàng)面組織的愈合。

Wnt/β-catenin 通路是調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡經(jīng)典的信號通路之一。該通路的經(jīng)典上游分子Wnt1 激活后能夠使GSK-3β 發(fā)生磷酸化，而磷酸化的GSK-3β 可使β-catenin 的降解減弱，進而調(diào)節(jié)多種基因的表達并促進細胞增殖[29]。糖尿病足患者體內(nèi)的高糖、感染等因素使得Wnt通路的信號轉(zhuǎn)導受阻，進而抑制創(chuàng)面內(nèi)細胞增殖，不利于創(chuàng)面的修復[30]。本研究結(jié)果顯示，DFU 組大鼠創(chuàng)面組織Wnt1、Wnt3a 和β-catenin 顯著低于普通潰瘍組，術(shù)前、術(shù)后銀杏葉提取物注射液治療后，DFU 大鼠創(chuàng)面組織Wnt1和Wnt3a表達明顯升高（P＜0.05）。提示創(chuàng)面局部給予銀杏葉提取物注射液激活了創(chuàng)面組織Wnt/β-catenin 信號通路活性，從而促進糖尿病足創(chuàng)口組織的修復。

本研究設(shè)置了普通潰瘍組，將銀杏葉提取物注射液治療DFU 的效果與正常潰瘍自然愈合的效果進行對比，用以表征銀杏葉提取物注射液對于DFU大鼠潰瘍的改善程度。同時，設(shè)置了普通潰瘍+術(shù)前術(shù)后注射組、普通潰瘍+術(shù)后注射組，發(fā)現(xiàn)術(shù)前術(shù)后注射的普通潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合率在術(shù)后2周內(nèi)均顯著高于未注射大鼠，且在第3周時，創(chuàng)面愈合率達到100%，效果優(yōu)于未注射和僅術(shù)后注射的大鼠。

綜上所述，DFU大鼠創(chuàng)面局部注射銀杏葉提取物注射液治療，可通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，減少炎癥細胞因子分泌，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效提高創(chuàng)面愈合率，促進創(chuàng)面微血管生成，為臨床DFU的治療提供借鑒。