原花青素對燙傷大鼠創(chuàng)面愈合及VEGF/VEGFR表達的影響*

張同威，鄭文杰，劉 巖，安立輝

（1.沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科，沈陽 110003；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001）

燙傷是指熱液、熱氣引起的嚴重的皮膚損傷，形成燙傷創(chuàng)面，造成血管內(nèi)皮細胞受損，大面積的燙傷會造成休克，引起組織缺血，造成器官損害甚至死亡[1-2]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為特異性促血管內(nèi)皮細胞生長的生物因子，在受損傷組織的細胞修復、細胞增殖中發(fā)揮重要作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）能與VEGF特異性結合，直接作用于血管及內(nèi)皮細胞的生成，在血管生成及細胞增生中共同發(fā)揮重要作用，且在燙傷形成的創(chuàng)面組織中高表達，加速創(chuàng)面的愈合[4-6]。

原花青素作為一種常見的植物提取物，含有多種多酚類化合物，廣泛存在于多種植物的果皮及種子中[7]。目前原花青素已經(jīng)被證實具有多種有益活性，其自身特異性的化學結構使其具有很強的抗氧化能力，目前已被應用于多種疾病治療，如心肌缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化等[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可以有效緩解血管細胞衰老，清除血管雜質(zhì)，進而保護血管細胞，使血管恢復彈性，同時還可以消除水腫，改善血液循環(huán)[9-10]。原花青素B2 可顯著改善糖尿病大鼠創(chuàng)面損傷，加速創(chuàng)面愈合，但其作用機理尚未明確[11]，推測原花青素對于燙傷形成的皮膚缺損同樣具有良好的治療效果，原花青素是否可應用于燙傷后的創(chuàng)面愈合治療有待進一步探索，相關機理也有待明確。本研究以燙傷大鼠實驗模型為實驗對象，探究原花青素對其創(chuàng)面愈合及VEGF/VEGFR信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

原花青素（貨號R606076）購于成都歐恩瑞思化學試劑有限公司；脫毛膏（貨號201828545）購于鎮(zhèn)平時通實業(yè)有限公司；燒燙傷膏（國藥準字Z22021421）購于長春海外制藥集團有限公司；乳酸林格氏液（貨號ZC-A0302）購于上海茁彩生物科技有限公司；VEGF 抑制劑SB-267268（貨號HY-19306）購于MCE 公司；蘇木精—伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色試劑盒（貨號BC-DL-001）購于南京生航生物技術有限公司；GAPDH 抗體（貨號ab9485）、VEGF 抗體（貨號ab150375）、VEGFR2 抗體（貨號ab233693）購于abcam公司；羊抗兔二抗（貨號A9169）購于德國Merck 公司；熒光定量PCR 儀（7500，ABI 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（HE-120，上海生工生物有限公司）。

1.2 動物模型的構建

清潔級SD 雄性大鼠共計120 只，8 周齡，體重（300±10）g，許可證號SCXK(津)2020-0005，購于天津市中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。將大鼠隨機分為健康組、燙傷組、原花青素高劑量組、原花青素低劑量組、陽性對照組、原花青素+VEGF抑制組，每組20只。各組大鼠背部相同部位選取直徑3 cm 的圓形區(qū)域，涂抹脫毛膏，均勻涂抹確保徹底去毛，消毒處理。而后將燙傷組、原花青素高劑量組、原花青素低劑量組、陽性對照組、原花青素+VEGF 抑制組大鼠麻醉，俯臥位固定于操作臺上，將直徑為2.5 cm的鐵錘放于沸水中煮20 min，而后快速取出用無菌紗布擦干水分，將鐵錘按壓于大鼠背部脫毛處，確保鐵錘與背部緊貼，但不形成皮膚凹陷，持續(xù)8 s，快速向大鼠腹腔內(nèi)注射乳酸林格氏液3 mL，各組大鼠均單獨飼養(yǎng)，防止相互抓傷背部燙傷組織。模型構建成功后，各組大鼠每日早中晚各用生理鹽水清洗1次，滴加涂抹碘伏消毒，原花青素高劑量組消毒后在燙傷部位均勻涂抹原花青素溶液（30 mg/mL，生理鹽水溶解）；原花青素低劑量組均勻涂抹原花青素溶液（5 mg/mL，生理鹽水溶解）；陽性對照組均勻涂抹燒燙傷膏；原花青素+VEGF抑制組涂抹原花青素溶液（30 mg/mL，生理鹽水溶解），同時腹腔注射VEGF 抑制劑SB-267268（5 mg/kg），各組處理直至傷口完全愈合為止。

1.3 大鼠創(chuàng)面愈合指標檢測

裁剪出直徑為2.5 cm 的圓形半透明紙若干，稱重記作半透明紙總重量，模擬大鼠背部燙傷皮膚組織。在大鼠燙傷模型構建后用藥的第1、5、10、15、20 天分別于半透明紙上描繪各組大鼠背部創(chuàng)面圖形，并稱取背部創(chuàng)面圖形區(qū)域的重量，通過公式計算創(chuàng)面愈合率。每天觀察記錄傷口出現(xiàn)上皮組織及傷口完全愈合時間，公式如下：

創(chuàng)面愈合率=（半透明紙總重量-背部創(chuàng)面圖形區(qū)域的重量）/半透明紙總重量

1.4 大鼠創(chuàng)面組織病理學變化觀察

傷口用藥15 d后，各組隨機挑選10只大鼠麻醉處理，剩余大鼠繼續(xù)觀察記錄創(chuàng)面愈合情況。手術剪剪下麻醉大鼠背部完整的創(chuàng)面組織，部分組織充分剪碎后加入液氮研磨處理，放入-80 ℃凍存?zhèn)溆?。剩余部分浸泡?%福爾馬林中固定，磷酸緩沖鹽溶液清洗后，不同濃度的乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作切片（厚度4 μm），脫蠟至水，按照HE染色試劑盒說明書方法染色，樹脂封片，上鏡觀察病理學變化。

1.5 創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA檢測

取出凍存?zhèn)溆玫膭?chuàng)面組織粉末少許，加入少量Trizol，充分混勻，加入1 mL的氯仿，充分混勻，靜置片刻，4 ℃12 000 r/min離心5 min，取上層清液加入等量的異丙醇，靜置片刻后4 ℃12 000 r/min 離心5 min 后棄上清。加入0.5 mL 75%酒精反復吹打，晾干后加水溶解。檢測提取的RNA濃度，定量后反轉(zhuǎn)錄，上機檢測VEGF、VEGFR2 mRNA 的表達水平。mRNA 引物序列由Primer 3.1 軟件設計，于廣州吉賽生物公司合成。引物序列如下：①GAPDH Sense primer：5'-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，Antisense primer：5'-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3'；②VEGF Sense primer：5'-CCTGGCTTTACTGCTG TACCT-3'，Antisense primer：5'-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3'；③VEGFR2 Sense primer：5'-AACCATTGGTGAGACCATCGA-3'，Antisense primer：5'-GGTTCCGGTTCCCGTCTT-3'。

1.6 創(chuàng)面皮膚組織VEGF、VEGFR2蛋白檢測

取出凍存?zhèn)溆玫膭?chuàng)面組織粉末少許，加入組織裂解液充分裂解，加入1 mL 提取液，靜置片刻后4 ℃12 000 r/min離心5 min，收集蛋白，定量變性后加入孔道中，跑膠后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，取出用脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（GAPDH 抗體、VEGF 抗體、VEGFR2 抗體，1∶1 500），4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3 次，加入二抗（1∶1 000），常溫孵育40 min，TBST 清洗3 次，將發(fā)光液混合倒于膜上，室溫下浸泡2 min，而后取出，濾紙吸干多余液體，并置于Syngene光密度掃描系統(tǒng)上進行條帶灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均值±標準差（）表示，組間差異比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原花青素對燙傷大鼠創(chuàng)面愈合指標的影響

燙傷大鼠愈合中的第1、5、10、15、20 天，與燙傷組相比，原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P＜0.05）；與原花青素高劑量組相比，原花青素低劑量組、陽性對照組、原花青素+VEGF抑制組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低（P＜0.05），見表1。燙傷組大鼠上皮出現(xiàn)時間及傷口完全愈合時間顯著長于原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽性對照組（P＜0.05）；原花青素高劑量組上皮出現(xiàn)時間及傷口完全愈合時間顯著短于原花青素低劑量組、陽性對照組、原花青素+VEGF抑制組（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠燙傷后不同時間創(chuàng)面愈合率的比較 ，%，n=10

表1 各組大鼠燙傷后不同時間創(chuàng)面愈合率的比較 ，%，n=10

與燙傷組相比，*P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，#P＜0.05。

表2 各組大鼠燙傷后上皮出現(xiàn)時間、完全愈合時間的比較 ，n=10

表2 各組大鼠燙傷后上皮出現(xiàn)時間、完全愈合時間的比較 ，n=10

與燙傷組相比，*P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，#P＜0.05。

2.2 原花青素對燙傷大鼠創(chuàng)面組織病理變化的影響

健康組大鼠具有正常的皮膚組織，上皮細胞排列緊密，具有明顯的層次區(qū)分，真皮內(nèi)纖維排列整齊，未出現(xiàn)炎細胞；燙傷組大鼠上皮組織完全壞死，層次增厚，真皮內(nèi)纖維組織排列紊亂，出現(xiàn)大量炎癥細胞；原花青素高劑量組大鼠上皮細胞逐漸增多，形成多個層次，真皮內(nèi)纖維組織恢復正常，未見殘留炎癥細胞；原花青素低劑量組、陽性對照組、原花青素+VEGF抑制組上皮組織恢復較慢，層次尚未明確，真皮內(nèi)纖維組織排列松散，殘留少量炎癥細胞，見圖1。

圖1 HE染色觀察燙傷大鼠創(chuàng)面組織病理變化

2.3 原花青素對燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA表達的影響

燙傷組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA表達量顯著高于健康組（P＜0.05）；原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達量顯著高于燙傷組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達量顯著高于原花青素低劑量組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA表達量與陽性對照組、原花青素+VEGF 抑制組相比無顯著差異（P＞0.05），見表3。

表3 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達量的比較 ，n=10

表3 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達量的比較 ，n=10

與健康組相比，*P＜0.05；與燙傷組相比，#P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，※P＜0.05。

2.4 原花青素對燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白表達的影響

燙傷組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達量顯著高于健康組（P＜0.05）；原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達量顯著高于燙傷組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達量顯著高于原花青素低劑量組、原花青素+VEGF 抑制組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達量與陽性對照組相比無顯著差異（P＞0.05），見圖2、表4。

圖2 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白表達情況

表4 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白的表達 ，n=10

表4 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白的表達 ，n=10

與健康組相比，*P＜0.05；與燙傷組相比，#P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，※P＜0.05。

3 討論

燙傷作為一種常見的疾病，主要以體表皮膚的熱損傷為主，可引起上皮細胞壞死，嚴重時會危害真皮下的纖維組織，嚴重影響人類的健康和生命安全[12]。古往今來，有多種中醫(yī)藥應用于燙傷的治療，并在治療燙傷的過程中取得了良好的效果，目前常見的治療藥物如燒燙傷膏就具有多種中醫(yī)藥成分[13]。然而，隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，對于燙傷的治療要求不再僅僅局限于消除疾病，還要注意確?；颊咴跔C傷恢復的同時，快速形成創(chuàng)面愈合，以防止出現(xiàn)瘢痕，對患者造成困擾[14]。因此，開發(fā)快速形成創(chuàng)面愈合的藥物成為重中之重。鑒于中醫(yī)藥在治療燙傷的研究中已被證實具有很好的療效，針對中醫(yī)藥的研究成為熱點[15]。原花青素內(nèi)含多種有機成分，具有強抗氧化性，還可保護細胞，促進細胞恢復，可加速組織愈合，推測原花青素很可能對于燙傷引起的皮膚損傷同樣具有促進創(chuàng)面愈合的作用[16]。本研究通過使用加熱的高溫鐵錘燙傷大鼠以構建模型，以燒燙傷膏治療作為陽性對照，依據(jù)參考文獻，將燙傷后各組大鼠的上皮出現(xiàn)時間、傷口完全愈合時間作為判斷創(chuàng)面愈合情況的重要指標，并依據(jù)文獻中創(chuàng)面愈合率的計算方法，統(tǒng)計不同時間段大鼠創(chuàng)面愈合率的變化情況[17-18]。發(fā)現(xiàn)燙傷后不同時間段，涂抹高劑量原花青素大鼠的創(chuàng)面愈合率顯著高于涂抹低劑量原花青素和涂抹燒燙傷膏的大鼠，且涂抹高劑量原花青素大鼠的上皮出現(xiàn)時間及傷口完全愈合時間也顯著低于涂抹低劑量原花青素和涂抹燒燙傷膏的大鼠，表明原花青素可以有效緩解燙傷，并加速創(chuàng)面愈合，且治療效果優(yōu)于常見治療藥物。

有文獻指出，創(chuàng)面組織是外傷致病因子對皮膚造成直接傷害所形成的，是燙傷過程中受損最直接的皮膚組織，還是判斷燙傷程度及恢復狀況的重要組織結構[19]。通過HE 染色對各組大鼠創(chuàng)面組織的觀察，發(fā)現(xiàn)燙傷后大鼠上皮組織完全壞死，真皮內(nèi)纖維組織紊亂，且出現(xiàn)大量炎癥細胞。涂抹低劑量原花青素和涂抹燒燙傷膏的大鼠上皮組織開始恢復，但恢復速度較慢，真皮內(nèi)纖維組織依然松散，且存在少量炎癥細胞。而涂抹高劑量原花青素的大鼠上皮組織出現(xiàn)大量的新生的上皮細胞，且真皮內(nèi)纖維組織恢復正常，炎癥細胞消失，表明原花青素對燙傷大鼠的上皮組織及真皮內(nèi)纖維組織具有良好的緩解和保護作用，且效果優(yōu)于常見治療藥物，但其作用機制還有待探索。

近年有文獻指出，VEGF 作為細胞生長的重要生物因子，在受損傷組織中發(fā)揮重要作用。有研究證實，VEGF 的高表達可幫助恢復燙傷創(chuàng)面的血管形成，促進創(chuàng)面中晚期的愈合[20]。VEGF 高表達的同時促進其特異性結合受體VEGFR2的高表達，可參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞增殖，加速血管生成，促進創(chuàng)面愈合[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白的表達量顯著升高，原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達量顯著高于原花青素低劑量組，原花青素高劑量組與陽性對照組VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達量無顯著差異，說明原花青素可能參與調(diào)控VEGF、VEGFR2的表達，通過促進其表達，加速創(chuàng)面的愈合，并具有劑量依賴性。為進一步驗證這一結論，本實驗在高劑量原花青素作用的同時抑制VEGF 表達，發(fā)現(xiàn)與原花青素高劑量組相比，原花青素+VEGF抑制組VEGF、VEGFR2蛋白表達量顯著降低，同時，創(chuàng)面恢復明顯減緩，創(chuàng)面愈合率顯著降低，上皮出現(xiàn)時間、完全愈合時間顯著延長。證實原花青素通過調(diào)控VEGF、VEGFR2 的表達，加速創(chuàng)面愈合。

綜上所述，原花青素能調(diào)控VEGF/VEGFR信號通路中VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白的表達，促進上皮細胞新生，減輕炎癥反應，使真皮內(nèi)纖維組織恢復正常，加速創(chuàng)面組織的恢復，從而緩解燙傷危害。以上研究表明，原花青素對于燙傷具有良好的恢復作用，有很大的應用空間，可嘗試用于開發(fā)治療藥物。VEGF/VEGFR 信號通路可能作為原花青素作用的重要靶點，但原花青素具有多種藥物活性，參與多條通路的調(diào)節(jié)，通過何種通路調(diào)節(jié)燙傷創(chuàng)面組織的恢復，仍有待進一步的研究加以說明。