原花青素對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面愈合及VEGF/VEGFR表達(dá)的影響*

張同威，鄭文杰，劉 巖，安立輝

（1.沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng) 110003；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng) 110001）

燙傷是指熱液、熱氣引起的嚴(yán)重的皮膚損傷，形成燙傷創(chuàng)面，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，大面積的燙傷會(huì)造成休克，引起組織缺血，造成器官損害甚至死亡[1-2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的生物因子，在受損傷組織的細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）能與VEGF特異性結(jié)合，直接作用于血管及內(nèi)皮細(xì)胞的生成，在血管生成及細(xì)胞增生中共同發(fā)揮重要作用，且在燙傷形成的創(chuàng)面組織中高表達(dá)，加速創(chuàng)面的愈合[4-6]。

原花青素作為一種常見(jiàn)的植物提取物，含有多種多酚類(lèi)化合物，廣泛存在于多種植物的果皮及種子中[7]。目前原花青素已經(jīng)被證實(shí)具有多種有益活性，其自身特異性的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有很強(qiáng)的抗氧化能力，目前已被應(yīng)用于多種疾病治療，如心肌缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化等[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可以有效緩解血管細(xì)胞衰老，清除血管雜質(zhì)，進(jìn)而保護(hù)血管細(xì)胞，使血管恢復(fù)彈性，同時(shí)還可以消除水腫，改善血液循環(huán)[9-10]。原花青素B2 可顯著改善糖尿病大鼠創(chuàng)面損傷，加速創(chuàng)面愈合，但其作用機(jī)理尚未明確[11]，推測(cè)原花青素對(duì)于燙傷形成的皮膚缺損同樣具有良好的治療效果，原花青素是否可應(yīng)用于燙傷后的創(chuàng)面愈合治療有待進(jìn)一步探索，相關(guān)機(jī)理也有待明確。本研究以燙傷大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，探究原花青素對(duì)其創(chuàng)面愈合及VEGF/VEGFR信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

原花青素（貨號(hào)R606076）購(gòu)于成都?xì)W恩瑞思化學(xué)試劑有限公司；脫毛膏（貨號(hào)201828545）購(gòu)于鎮(zhèn)平時(shí)通實(shí)業(yè)有限公司；燒燙傷膏（國(guó)藥準(zhǔn)字Z22021421）購(gòu)于長(zhǎng)春海外制藥集團(tuán)有限公司；乳酸林格氏液（貨號(hào)ZC-A0302）購(gòu)于上海茁彩生物科技有限公司；VEGF 抑制劑SB-267268（貨號(hào)HY-19306）購(gòu)于MCE 公司；蘇木精—伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色試劑盒（貨號(hào)BC-DL-001）購(gòu)于南京生航生物技術(shù)有限公司；GAPDH 抗體（貨號(hào)ab9485）、VEGF 抗體（貨號(hào)ab150375）、VEGFR2 抗體（貨號(hào)ab233693）購(gòu)于abcam公司；羊抗兔二抗（貨號(hào)A9169）購(gòu)于德國(guó)Merck 公司；熒光定量PCR 儀（7500，ABI 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（HE-120，上海生工生物有限公司）。

1.2 動(dòng)物模型的構(gòu)建

清潔級(jí)SD 雄性大鼠共計(jì)120 只，8 周齡，體重（300±10）g，許可證號(hào)SCXK(津)2020-0005，購(gòu)于天津市中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。將大鼠隨機(jī)分為健康組、燙傷組、原花青素高劑量組、原花青素低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、原花青素+VEGF抑制組，每組20只。各組大鼠背部相同部位選取直徑3 cm 的圓形區(qū)域，涂抹脫毛膏，均勻涂抹確保徹底去毛，消毒處理。而后將燙傷組、原花青素高劑量組、原花青素低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、原花青素+VEGF 抑制組大鼠麻醉，俯臥位固定于操作臺(tái)上，將直徑為2.5 cm的鐵錘放于沸水中煮20 min，而后快速取出用無(wú)菌紗布擦干水分，將鐵錘按壓于大鼠背部脫毛處，確保鐵錘與背部緊貼，但不形成皮膚凹陷，持續(xù)8 s，快速向大鼠腹腔內(nèi)注射乳酸林格氏液3 mL，各組大鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)，防止相互抓傷背部燙傷組織。模型構(gòu)建成功后，各組大鼠每日早中晚各用生理鹽水清洗1次，滴加涂抹碘伏消毒，原花青素高劑量組消毒后在燙傷部位均勻涂抹原花青素溶液（30 mg/mL，生理鹽水溶解）；原花青素低劑量組均勻涂抹原花青素溶液（5 mg/mL，生理鹽水溶解）；陽(yáng)性對(duì)照組均勻涂抹燒燙傷膏；原花青素+VEGF抑制組涂抹原花青素溶液（30 mg/mL，生理鹽水溶解），同時(shí)腹腔注射VEGF 抑制劑SB-267268（5 mg/kg），各組處理直至傷口完全愈合為止。

1.3 大鼠創(chuàng)面愈合指標(biāo)檢測(cè)

裁剪出直徑為2.5 cm 的圓形半透明紙若干，稱(chēng)重記作半透明紙總重量，模擬大鼠背部燙傷皮膚組織。在大鼠燙傷模型構(gòu)建后用藥的第1、5、10、15、20 天分別于半透明紙上描繪各組大鼠背部創(chuàng)面圖形，并稱(chēng)取背部創(chuàng)面圖形區(qū)域的重量，通過(guò)公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率。每天觀察記錄傷口出現(xiàn)上皮組織及傷口完全愈合時(shí)間，公式如下：

創(chuàng)面愈合率=（半透明紙總重量-背部創(chuàng)面圖形區(qū)域的重量）/半透明紙總重量

1.4 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化觀察

傷口用藥15 d后，各組隨機(jī)挑選10只大鼠麻醉處理，剩余大鼠繼續(xù)觀察記錄創(chuàng)面愈合情況。手術(shù)剪剪下麻醉大鼠背部完整的創(chuàng)面組織，部分組織充分剪碎后加入液氮研磨處理，放入-80 ℃凍存?zhèn)溆谩ＪＳ嗖糠纸萦?%福爾馬林中固定，磷酸緩沖鹽溶液清洗后，不同濃度的乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作切片（厚度4 μm），脫蠟至水，按照HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)方法染色，樹(shù)脂封片，上鏡觀察病理學(xué)變化。

1.5 創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA檢測(cè)

取出凍存?zhèn)溆玫膭?chuàng)面組織粉末少許，加入少量Trizol，充分混勻，加入1 mL的氯仿，充分混勻，靜置片刻，4 ℃12 000 r/min離心5 min，取上層清液加入等量的異丙醇，靜置片刻后4 ℃12 000 r/min 離心5 min 后棄上清。加入0.5 mL 75%酒精反復(fù)吹打，晾干后加水溶解。檢測(cè)提取的RNA濃度，定量后反轉(zhuǎn)錄，上機(jī)檢測(cè)VEGF、VEGFR2 mRNA 的表達(dá)水平。mRNA 引物序列由Primer 3.1 軟件設(shè)計(jì)，于廣州吉賽生物公司合成。引物序列如下：①GAPDH Sense primer：5'-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，Antisense primer：5'-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3'；②VEGF Sense primer：5'-CCTGGCTTTACTGCTG TACCT-3'，Antisense primer：5'-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3'；③VEGFR2 Sense primer：5'-AACCATTGGTGAGACCATCGA-3'，Antisense primer：5'-GGTTCCGGTTCCCGTCTT-3'。

1.6 創(chuàng)面皮膚組織VEGF、VEGFR2蛋白檢測(cè)

取出凍存?zhèn)溆玫膭?chuàng)面組織粉末少許，加入組織裂解液充分裂解，加入1 mL 提取液，靜置片刻后4 ℃12 000 r/min離心5 min，收集蛋白，定量變性后加入孔道中，跑膠后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，取出用脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（GAPDH 抗體、VEGF 抗體、VEGFR2 抗體，1∶1 500），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 清洗3 次，加入二抗（1∶1 000），常溫孵育40 min，TBST 清洗3 次，將發(fā)光液混合倒于膜上，室溫下浸泡2 min，而后取出，濾紙吸干多余液體，并置于Syngene光密度掃描系統(tǒng)上進(jìn)行條帶灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原花青素對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面愈合指標(biāo)的影響

燙傷大鼠愈合中的第1、5、10、15、20 天，與燙傷組相比，原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P＜0.05）；與原花青素高劑量組相比，原花青素低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、原花青素+VEGF抑制組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。燙傷組大鼠上皮出現(xiàn)時(shí)間及傷口完全愈合時(shí)間顯著長(zhǎng)于原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）；原花青素高劑量組上皮出現(xiàn)時(shí)間及傷口完全愈合時(shí)間顯著短于原花青素低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、原花青素+VEGF抑制組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠燙傷后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的比較 ，%，n=10

表1 各組大鼠燙傷后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的比較 ，%，n=10

與燙傷組相比，*P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，#P＜0.05。

表2 各組大鼠燙傷后上皮出現(xiàn)時(shí)間、完全愈合時(shí)間的比較 ，n=10

表2 各組大鼠燙傷后上皮出現(xiàn)時(shí)間、完全愈合時(shí)間的比較 ，n=10

與燙傷組相比，*P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，#P＜0.05。

2.2 原花青素對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面組織病理變化的影響

健康組大鼠具有正常的皮膚組織，上皮細(xì)胞排列緊密，具有明顯的層次區(qū)分，真皮內(nèi)纖維排列整齊，未出現(xiàn)炎細(xì)胞；燙傷組大鼠上皮組織完全壞死，層次增厚，真皮內(nèi)纖維組織排列紊亂，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞；原花青素高劑量組大鼠上皮細(xì)胞逐漸增多，形成多個(gè)層次，真皮內(nèi)纖維組織恢復(fù)正常，未見(jiàn)殘留炎癥細(xì)胞；原花青素低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、原花青素+VEGF抑制組上皮組織恢復(fù)較慢，層次尚未明確，真皮內(nèi)纖維組織排列松散，殘留少量炎癥細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察燙傷大鼠創(chuàng)面組織病理變化

2.3 原花青素對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)的影響

燙傷組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)量顯著高于健康組（P＜0.05）；原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達(dá)量顯著高于燙傷組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達(dá)量顯著高于原花青素低劑量組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組、原花青素+VEGF 抑制組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達(dá)量的比較 ，n=10

表3 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA 表達(dá)量的比較 ，n=10

與健康組相比，*P＜0.05；與燙傷組相比，#P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，※P＜0.05。

2.4 原花青素對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響

燙傷組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達(dá)量顯著高于健康組（P＜0.05）；原花青素低劑量組、原花青素高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達(dá)量顯著高于燙傷組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達(dá)量顯著高于原花青素低劑量組、原花青素+VEGF 抑制組（P＜0.05）；原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 蛋白表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2、表4。

圖2 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)情況

表4 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白的表達(dá) ，n=10

表4 各組燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2蛋白的表達(dá) ，n=10

與健康組相比，*P＜0.05；與燙傷組相比，#P＜0.05；與原花青素高劑量組相比，※P＜0.05。

3 討論

燙傷作為一種常見(jiàn)的疾病，主要以體表皮膚的熱損傷為主，可引起上皮細(xì)胞壞死，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危害真皮下的纖維組織，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康和生命安全[12]。古往今來(lái)，有多種中醫(yī)藥應(yīng)用于燙傷的治療，并在治療燙傷的過(guò)程中取得了良好的效果，目前常見(jiàn)的治療藥物如燒燙傷膏就具有多種中醫(yī)藥成分[13]。然而，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)于燙傷的治療要求不再僅僅局限于消除疾病，還要注意確保患者在燙傷恢復(fù)的同時(shí)，快速形成創(chuàng)面愈合，以防止出現(xiàn)瘢痕，對(duì)患者造成困擾[14]。因此，開(kāi)發(fā)快速形成創(chuàng)面愈合的藥物成為重中之重。鑒于中醫(yī)藥在治療燙傷的研究中已被證實(shí)具有很好的療效，針對(duì)中醫(yī)藥的研究成為熱點(diǎn)[15]。原花青素內(nèi)含多種有機(jī)成分，具有強(qiáng)抗氧化性，還可保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)，可加速組織愈合，推測(cè)原花青素很可能對(duì)于燙傷引起的皮膚損傷同樣具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用[16]。本研究通過(guò)使用加熱的高溫鐵錘燙傷大鼠以構(gòu)建模型，以燒燙傷膏治療作為陽(yáng)性對(duì)照，依據(jù)參考文獻(xiàn)，將燙傷后各組大鼠的上皮出現(xiàn)時(shí)間、傷口完全愈合時(shí)間作為判斷創(chuàng)面愈合情況的重要指標(biāo)，并依據(jù)文獻(xiàn)中創(chuàng)面愈合率的計(jì)算方法，統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間段大鼠創(chuàng)面愈合率的變化情況[17-18]。發(fā)現(xiàn)燙傷后不同時(shí)間段，涂抹高劑量原花青素大鼠的創(chuàng)面愈合率顯著高于涂抹低劑量原花青素和涂抹燒燙傷膏的大鼠，且涂抹高劑量原花青素大鼠的上皮出現(xiàn)時(shí)間及傷口完全愈合時(shí)間也顯著低于涂抹低劑量原花青素和涂抹燒燙傷膏的大鼠，表明原花青素可以有效緩解燙傷，并加速創(chuàng)面愈合，且治療效果優(yōu)于常見(jiàn)治療藥物。

有文獻(xiàn)指出，創(chuàng)面組織是外傷致病因子對(duì)皮膚造成直接傷害所形成的，是燙傷過(guò)程中受損最直接的皮膚組織，還是判斷燙傷程度及恢復(fù)狀況的重要組織結(jié)構(gòu)[19]。通過(guò)HE 染色對(duì)各組大鼠創(chuàng)面組織的觀察，發(fā)現(xiàn)燙傷后大鼠上皮組織完全壞死，真皮內(nèi)纖維組織紊亂，且出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞。涂抹低劑量原花青素和涂抹燒燙傷膏的大鼠上皮組織開(kāi)始恢復(fù)，但恢復(fù)速度較慢，真皮內(nèi)纖維組織依然松散，且存在少量炎癥細(xì)胞。而涂抹高劑量原花青素的大鼠上皮組織出現(xiàn)大量的新生的上皮細(xì)胞，且真皮內(nèi)纖維組織恢復(fù)正常，炎癥細(xì)胞消失，表明原花青素對(duì)燙傷大鼠的上皮組織及真皮內(nèi)纖維組織具有良好的緩解和保護(hù)作用，且效果優(yōu)于常見(jiàn)治療藥物，但其作用機(jī)制還有待探索。

近年有文獻(xiàn)指出，VEGF 作為細(xì)胞生長(zhǎng)的重要生物因子，在受損傷組織中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)，VEGF 的高表達(dá)可幫助恢復(fù)燙傷創(chuàng)面的血管形成，促進(jìn)創(chuàng)面中晚期的愈合[20]。VEGF 高表達(dá)的同時(shí)促進(jìn)其特異性結(jié)合受體VEGFR2的高表達(dá)，可參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速血管生成，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，燙傷大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著升高，原花青素高劑量組大鼠創(chuàng)面組織VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于原花青素低劑量組，原花青素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異，說(shuō)明原花青素可能參與調(diào)控VEGF、VEGFR2的表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)其表達(dá)，加速創(chuàng)面的愈合，并具有劑量依賴(lài)性。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)在高劑量原花青素作用的同時(shí)抑制VEGF 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與原花青素高劑量組相比，原花青素+VEGF抑制組VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)量顯著降低，同時(shí)，創(chuàng)面恢復(fù)明顯減緩，創(chuàng)面愈合率顯著降低，上皮出現(xiàn)時(shí)間、完全愈合時(shí)間顯著延長(zhǎng)。證實(shí)原花青素通過(guò)調(diào)控VEGF、VEGFR2 的表達(dá)，加速創(chuàng)面愈合。

綜上所述，原花青素能調(diào)控VEGF/VEGFR信號(hào)通路中VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞新生，減輕炎癥反應(yīng)，使真皮內(nèi)纖維組織恢復(fù)正常，加速創(chuàng)面組織的恢復(fù)，從而緩解燙傷危害。以上研究表明，原花青素對(duì)于燙傷具有良好的恢復(fù)作用，有很大的應(yīng)用空間，可嘗試用于開(kāi)發(fā)治療藥物。VEGF/VEGFR 信號(hào)通路可能作為原花青素作用的重要靶點(diǎn)，但原花青素具有多種藥物活性，參與多條通路的調(diào)節(jié)，通過(guò)何種通路調(diào)節(jié)燙傷創(chuàng)面組織的恢復(fù)，仍有待進(jìn)一步的研究加以說(shuō)明。