銀杏雙黃酮介導(dǎo)AMPK/COX-2通路對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響*

楊豐僑，柏 磊，盛玉清，季 娟，馬葵芬

（1.浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院，杭州 311100；2.江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院，鎮(zhèn)江 212000；3.南京醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系江蘇省神經(jīng)退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210000）

隨著我國工業(yè)化的迅猛發(fā)展，臭氧層的損害和嚴(yán)重惡化增加了人類紫外線受到暴露的危險(xiǎn)，我國的黑色素瘤發(fā)病率呈現(xiàn)出快速攀升和增長的態(tài)勢[1-2]。黑色素瘤具有高轉(zhuǎn)移率、侵襲性強(qiáng)、高死亡率及對(duì)化療藥物敏感性低，且極易產(chǎn)生耐藥性等特性[3]。據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性可有效降低細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[4]，凋亡及其調(diào)節(jié)因子是探究惡性黑色素瘤耐藥的重要機(jī)制。手術(shù)治療是最有效的治療黑色素瘤的方案，但由于黑色素瘤發(fā)病常隱襲且早期具有高轉(zhuǎn)移率，故不能及時(shí)手術(shù)治療[5]。目前臨床上使用的大部分治療藥物，如維羅非尼[6]、曲美替尼[7]、替莫唑胺[8-9]等，均有一定毒副作用，易引起致癌基因突變，增強(qiáng)患者耐藥性。故尋找毒副作用小，且療效好的抗腫瘤藥物至關(guān)重要。隨著我國中醫(yī)藥的進(jìn)步，越來越多的科學(xué)研究也證明，傳統(tǒng)的中藥活性成分，如芍藥苷，可顯著提高其對(duì)放療的敏感性，在腫瘤的治療過程中具有獨(dú)特的效果[10]，這也為黑色素瘤的治療開辟了一種新的思路。銀杏雙黃酮（Ginkgo biloba biflavones，GBB）是從銀杏葉中提純的化合物，具有抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，是一種極具開發(fā)潛力的物質(zhì)[11]。已有研究顯示，單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate activated protein kinase，AMPK）/環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）通路在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[12]，如吲哚類化合物GY3 可基于AMPK/COX-2通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[13]。因此，本研究通過研究GBB 對(duì)人黑色素瘤A875 細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探究AMPK/COX-2通路在此過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人黑色瘤細(xì)胞株A375、A875、WM115、MV3以及SK-Mel-28均購自美國ATCC中心；胎牛血清購自美國GEMINI（貨號(hào)：900-108）；0.25% 胰蛋白酶購自美國Hyclone（貨號(hào)：SH30042.01B）；DMEM 培養(yǎng)基購自上海HAKATA（貨號(hào)：A19008）；GBB購自安徽仕諾達(dá)（貨號(hào)：SND-1458，純度＞98%）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京BIOSIC（貨號(hào)：CC2210-20T）；AMPK抑制劑Compound C購自美國Merck（貨號(hào)：171260-1MG）；兔抗人p-AMPK、AMPK購自abcam公司（貨號(hào)依次為：ab133448、ab32047）；兔抗人p-ACC、COX-2、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）購自北京Bioss（貨號(hào)依次為：bs-0061R-2、bs-10411R-2、bs-0061R-2）；兔抗人ACC 購自上海谷研（貨號(hào)：GOY-K3691 A）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 購自中國萬類生物（貨號(hào)：WLA023）；聚偏氟乙烯膜（PVDF 膜）購自美國Millipore（貨號(hào)：IPVH00010）；ECL 化學(xué)發(fā)光劑購自上海碧云天（貨號(hào)：P0018FM）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人黑色瘤細(xì)胞株在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)（5%CO2，95%濕度），當(dāng)細(xì)胞生長超過80%培養(yǎng)瓶面積后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，添加0.25%胰蛋白酶消化液消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞回縮變小、變圓后添加適量的培養(yǎng)基終止消化，再輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮，將懸浮液轉(zhuǎn)移至新的15 mL離心管中，離心1 000 r/min 5 min，去上清，加入12 mL 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，后按照1∶2的比例分瓶傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及處理 取處于對(duì)數(shù)期生長的人黑色素瘤細(xì)胞，使用PBS清洗3次，加入0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞于離心管中，離心后，去上清后，加入新培養(yǎng)基，輕輕吹打至懸浮，使細(xì)胞濃度至105個(gè)/mL 后于6 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后換新的培養(yǎng)基，依次添加0 μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L、200 μmol/L 的GBB 處理，每個(gè)處理設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再次培養(yǎng)細(xì)胞，依次添加0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L GBB 以及10 μmol/L Compound C[14]，200 μmol/L GBB+10 μmol/L Compound C，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，隨后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，將對(duì)數(shù)期生長的各個(gè)株系的人黑色素瘤細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后添加胰蛋白酶消化終止培養(yǎng)，后加入適量CCK-8溶液于37 ℃避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測定各孔細(xì)胞在490 nm波長處的光密度值（OD）。細(xì)胞增殖活力（100%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡24 h后取出6孔板，添加胰蛋白酶消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞至懸浮，收集GBB處理下各組細(xì)胞，離心棄上清，提前預(yù)冷PBS清洗3次后于各組各個(gè)離心管中依次加入Binding Buffer，使細(xì)胞懸浮，分別添加5 μL Annexin V-FITC 混勻后、再添加10 μL PI 溶液，輕輕混勻，25 ℃避光15 min。流式細(xì)胞儀檢測分析（Annexin V-FITC檢測凋亡早期細(xì)胞，Annexin V-FITC+PI 檢測凋亡中晚期細(xì)胞）不同濃度GBB 對(duì)A875 細(xì)胞凋亡率的影響。

1.6 Western blotting 法檢測細(xì)胞AMPK/COX-2 通路 相關(guān)蛋白表達(dá)24 h后取出6孔板，去上清，添加提前預(yù)冷的PBS 清洗3 次后，添加蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，充分裂解細(xì)胞，30 min后收集細(xì)胞，低溫離心10 min，吸取上清至新的離心管中，使用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，蛋白定量后，加入Loding buffer混合，95 ℃煮沸變性。取25 μg變性后蛋白樣品上樣，電泳后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，將PVDF 膜置于孵育盒中，依次適量添加一抗（p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2、β-actin，稀釋比例為1∶500），低溫孵育過夜，隔天使用TBST 漂洗3 次，添加二抗（按1∶5 000 稀釋）孵育，水平搖床孵育1.5 h，使用TBST漂洗3次，添加ECL 混合發(fā)光液曝光顯影。圖像使用Image J分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS25.0 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，單因素方差進(jìn)行顯著性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBB對(duì)不同人黑色素瘤細(xì)胞活力的影響與 0 μmol/L GBB 相比，不同濃度GBB（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）作用24 h 后，人黑色素瘤細(xì)胞的增殖率明顯降低，其中以A875 細(xì)胞增殖率受GBB影響變化最大，增殖率最低，故選擇A875作為后期實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，見表1。

表1 GBB對(duì)不同人黑色素瘤細(xì)胞增殖率的影響 %，，n=10

表1 GBB對(duì)不同人黑色素瘤細(xì)胞增殖率的影響 %，，n=10

與0 μmol/L GBB比較，aP＜0.05；與50 μmol/L GBB比較，bP＜0.05；與100 μmol/L GBB比較，cP＜0.05。

2.2 GBB對(duì)人黑色素瘤A875細(xì)胞生長形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察人黑色素瘤A875 細(xì)胞的生長形態(tài)，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁、緊密、單層生長，且大小均勻，具有很好的折光性。在不同濃度GBB（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）作用24 h 后，可明顯看出，隨著GBB 濃度的增高，A875細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞形態(tài)回縮變小、變圓、變亮，細(xì)胞間接觸消失，部分細(xì)胞脫落裂解為碎片狀，懸浮細(xì)胞越來越多，且折光性也隨著減弱，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，見圖1。

圖1 不同濃度GBB作用下人黑色素瘤A875細(xì)胞形態(tài)（×200）

2.3 GBB對(duì)人黑色素瘤A875細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度GBB（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）作用A875 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞凋亡率隨著GBB 濃度的增加而升高，且均明顯高于0 μmol/L GBB組（P＜0.05），見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測不同濃度GBB作用下的細(xì)胞凋亡率

2.4 不同濃度GBB 對(duì)人黑色素瘤A875 細(xì)胞中p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表達(dá)的影響 p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK 比值隨著GBB濃度的增加而升高（P＜0.05），COX-2蛋白表達(dá)水平則隨著GBB濃度的增加而降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 不同濃度GBB對(duì)p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表達(dá)的影響

2.5 GBB 聯(lián)合Compound C 對(duì)人黑色素瘤A875 細(xì)胞中p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表達(dá)的影響 與200 μmol/L GBB 相比，Compound C處理細(xì)胞中p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK比值明顯降低（P＜0.05），COX-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；200 μmol/L GBB+Compound C 處理細(xì)胞中p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK 比值降低明顯（P＜0.05），COX-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 GBB聯(lián)合Compound C對(duì)p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)持續(xù)發(fā)展，更多具有中藥作用的天然植物提取物受到研究學(xué)者的關(guān)注，中醫(yī)藥不僅可減輕患者的毒副作用，且影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過程[10]。GBB是銀杏葉中含量較低，極難提取的一種化合物，其部分生物活性優(yōu)于單黃酮，是一種極具潛力的雙黃酮類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮可通過調(diào)節(jié)CIP2A表達(dá)進(jìn)而達(dá)到抑制肺腺癌細(xì)胞生長，促進(jìn)凋亡的目的[15]。GBB 協(xié)同白藜蘆醇共同作用于血管內(nèi)皮生長因子，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，同時(shí)，進(jìn)而影響腫瘤微血管的生成[16]。本研究通過體外培養(yǎng)人黑色素瘤細(xì)胞A875發(fā)現(xiàn)，隨著GBB濃度的不斷增加，A875 細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，如細(xì)胞回縮、數(shù)量減少、懸浮細(xì)胞增多、折光性變差等多個(gè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，以上表明GBB可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。隨后，為了更進(jìn)一步驗(yàn)證GBB 是否具有誘導(dǎo)A875 細(xì)胞凋亡的作用，采用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度GBB作用下的A875 細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，A876 細(xì)胞早期凋亡率和中晚期凋亡率隨著GBB 濃度的提高呈現(xiàn)上升的趨勢，由圖3 可更直觀的看出人黑色素瘤細(xì)胞A875 凋亡率隨著GBB 濃度的提高而提高，且呈現(xiàn)劑量依賴性。以上實(shí)驗(yàn)表明，GBB 具有促進(jìn)A875細(xì)胞凋亡的作用，但其相關(guān)機(jī)制尚不明晰，為了進(jìn)一步探索GBB誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究又進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

AMPK/COX-2通路可參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展，AMPK 是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵因子，可促進(jìn)ATP的產(chǎn)生以及能量的代謝過程[17]。AMPK可抑制腫瘤代謝，是腫瘤預(yù)防及治療的關(guān)鍵位點(diǎn)，可以通過影響下游靶蛋白mTOR、COX-2及ACC等表達(dá)調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過AMPK/COX-2 信號(hào)通路參與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡[19]。吲哚類化合物GY3 可通過激活A(yù)MPK/COX-2 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 增殖，促進(jìn)其凋亡[13]。COX-2 屬于一種誘導(dǎo)酶，當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、炎性介質(zhì)、促癌劑等刺激時(shí)，其表達(dá)會(huì)有明顯的上升，已有多項(xiàng)研究證明COX-2可在多種腫瘤組織中高表達(dá)，可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[20]。有研究表明，COX-2 與抗腫瘤凋亡過程密切相關(guān)，在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，可明顯提高抗凋亡基因Bcl-2 水平，激活A(yù)TP介導(dǎo)通路或NF-κB通路進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，抑制CytC 釋放減少細(xì)胞凋亡，COX-2 可作為多種腫瘤治療靶點(diǎn)[21]。ACC 是AMPK 通路的關(guān)鍵靶蛋白，p-ACC可作為此通路激活的最佳指標(biāo)。已有研究證實(shí)，p-ACC 可在甲狀腺乳頭癌中高表達(dá)，且參與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，激活A(yù)MPK-ACC 通路促進(jìn)了甲狀腺乳頭癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[22]。本研究結(jié)果顯示，與0 μmol/L GBB 相比，添加不同濃度的GBB 可提高ACC、AMPK 磷酸化蛋白表達(dá)，降低COX-2 蛋白表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，提示GBB可能通過激活A(yù)MPK，抑制COX-2的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。隨后為了更深入的探究AMPK/COX-2通路調(diào)控黑色素瘤A875細(xì)胞凋亡機(jī)制，本研究添加AMPK 抑制劑Compound C 培養(yǎng)A875 細(xì) 胞24 h 發(fā)現(xiàn)，與200 μmol/L GBB相比，200 μmol/L GBB+Compound C處理細(xì)胞中p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK 比值顯著降低，COX-2蛋白表達(dá)顯著提高，說明當(dāng)GBB激活A(yù)MPK通路被Compound C 抑制時(shí)，改變了GBB 對(duì)COX-2表達(dá)的調(diào)控作用，驗(yàn)證了COX-2是AMPK的靶標(biāo)蛋白，進(jìn)一步體現(xiàn)了AMPK/COX-2 通路在GBB 調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞凋亡過程中的作用。

綜上所述，GBB可通過激活A(yù)MPK信號(hào)進(jìn)而抑制COX-2的表達(dá)，誘導(dǎo)人黑色素瘤A875細(xì)胞凋亡，本研究為GBB 運(yùn)用于黑色素瘤的治療提供了理論依據(jù)。本研究僅是初步探討GBB 誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，并未深入研究GBB對(duì)化療的敏感性作用。此外，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)制，GBB抑制A875 細(xì)胞COX-2 表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)A875 細(xì)胞凋亡是否還有其他通路的參與，有待后續(xù)進(jìn)行更深入的探究。