NOTCH2基因甲基化與幼年特發性關節炎的關系及其機制*

王 軍，張育民，馬 濤，宋 偉

（西安市紅會醫院關節外科，西安 710054）

幼年特發性關節炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）是小兒時期常見的結締組織病，以慢性關節滑膜炎為主要特征，常伴隨有全身多臟器功能損壞，臨床癥狀主要表現為疼痛、腫脹及活動受限，是導致小兒殘疾和失明的主要疾病之一。JIA是一種慢性疾病，目前尚無治愈的可能，其治療目標在于最大程度緩解患兒臨床癥狀，預防及減少器官損傷，進而改善患兒生活質量[1]。DNA甲基化在轉錄調控中起重要作用[2]。有研究發現患有各種自身免疫性疾病[包括類風濕性關節炎（RA），系統性紅斑狼瘡，炎癥性腸病和1型糖尿病]的個體中存在DNA甲基化現象。Morgan 首次描述了NOTCH基因，發現哺乳動物中有4個NOTCH受體（NOTCH1～NOTCH4）和5個NOTCH配體[3]。NOTCH受體與相鄰細胞之間的配體可相互作用并激活決定各種器官中細胞命運的途徑[4-5]。此外，在胚胎和成年組織中，NOTCH 信號在細胞分化，增殖和凋亡中發揮重要作用[3]。有學者發現在成人RA進展中NOTCH信號參與滑膜炎的發生，且在RA 成纖維滑膜細胞中NOTCH 高表達，且可以參與腫瘤壞死因子α（TNFα）介導的滑膜細胞炎性增殖。還有研究發現，促炎性細胞因子白介素（IL）-8 是由TNF-α 誘導產生的，且TNF-α 與JIA 發病機制有關[6]。但目前有關NOTCH2基因甲基化與JIA的關系及可能機制的研究報道較少。因此，本研究擬探討TNF-α治療前后NOTCH 信號傳導對JIA 患者的影響，以期為JIA 的靶向治療提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 樣本采集及細胞培養 收集2018 年1 月至2019 年1 月在西安市紅會醫院關節外科收治的JIA患兒，從使用抗TNF 治療前（T0）和治療后（用藥治療6 周后，Tend）抽取有關JIA 患者的血液樣本。所有研究參與者均簽署了書面知情同意書。研究方案已獲西安市紅會醫院的人類研究倫理委員會批準（批準號：201712003）。采用CD4 德國貝爾吉施格拉德巴赫（Miltenyi Biotec GmbH，MB）進行陽性選擇，分離CD4+T細胞，借助人CD4+T細胞分離試劑盒（Miltenyi Biotec GmbH）進一步純化。通過流式細胞術對CD4+T 細胞富集（細胞純度＞95%）。將純化的CD4+T 細胞以2×106/mL 的濃度接種到24 孔板中，用含10%的胎牛血清（FBS）RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，美國）培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。待其細胞融合度達85%以上時，分別用含地西他賓（Selleck Chemicals，美國，終濃度0.25μg/mL）[7]RPMI 1640培養基或NOTCH信號抑制劑NOTCH 通路抑制劑（Selleck Chemicals，終濃度75 μmol/L）[8]RPMI 1640p 培養基刺激了CD4+T 細胞96 h。隨后收獲細胞和上清液，其中NOTCH 通路抑制劑主要抑制NOTCH 1 信號的傳導。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 為分析在抗TNF 治療前后JIA中發生的遺傳學變化，本研究采用GSE89252和GSE89251 進行全基因組甲基化和表達譜分析。采用R 軟件（MacOS 版本）中的CHAMP（版本3.2）和limma軟件包（版本3.0）來探討T0組和Tend組中JIA 的基因甲基化和表達水平，并將結果顯示在熱圖中以便于進一步篩選及驗證。

1.2.2 甲基化特異性PCR（MSP）分析 分別從T0組與Tend 組患兒中提取CD4+T 細胞，并使用InvitrogenTM試劑盒（Thermo Fisher Scientific）提取兩組患兒細胞的基因組DNA。取EpiTect亞硫酸鹽試劑盒（QIAGEN，德國）來修飾DNA，然后用GenElute?哺乳動物基因組DNA 微量制備試劑盒（Sigma-Aldrich，美國）進一步純化DNA，應用瓊脂糖凝膠電泳進行甲基化和非甲基化引物擴增，引物序列見表1。

表1 甲基化及PCR引物序列情況

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）采用TRIzol 試劑（Invitrogen，美國）提取兩組患者的總RNA。通過Takara RNA PCR試劑盒（Takara，中國）進行逆轉錄。然后使用SYBR Green 檢測系統（Takara），采用RT-qPCR 用于定量NOTCH2的表達水平。內參基因為GAPDH，使用2-ΔΔCt公式計算相對表達量檢測。以上所有操作均嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 酶聯免疫吸附法（ELISA）采用人ELISA試劑盒（R＆D 公司，美國）測定T0、Tend 兩組患兒CD4+T細胞上清液中的IL-4和IL-8表達情況。

1.2.5 細胞活力檢測（MTT法）取T0組和Tend組對數生長期CD4+T 細胞，將以5×103個/mL 的細胞濃度接種到96 孔板中，用10%的胎牛血清（FBS）RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，美國）培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。次日獲得基線MTT 光密度（OD），獲得OD 值標的時間記為0 h。隨后分別依次加入20 μL 含不同濃度地西他賓的RPMI 1640 培養基，其濃度范圍為0～4 μmol/L，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h。待其結束后，采用MTT 法（Sigma-Aldrich）檢測各濃度下CD4+T 細胞的增殖情況。并繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 克隆形成 實驗按照制造商的說明進行細胞計數試劑盒（MedChemExpress）分析，以分析細胞的增殖能力。將轉染的細胞以每孔1×105個細胞的速度接種到各個平板孔中，然后與不同的處理方法（Con/ Decitabine/NOTCH2抑制劑）孵育48 h。隨后，使用酶標儀（Bio-Rad，Hercules，美國）來研究570 nm的OD值。

1.2.7 免疫印跡分析（WB）采用RIPA 裂解液（上海碧云天）提取兩組CD4+T細胞的總蛋白。每孔以30μg 總蛋白上樣，借助十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，Thermo Fisher Scientific）對其進行分離，采用濕法轉膜將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美國）上，采用一抗稀釋液與4 ℃下孵育過夜。其一抗分別為：全人源NOTCH2多克隆抗體（1∶1 000）、全人源NICD 多克隆抗體（1∶1 000），全人源HES1 多克隆抗體（1∶1 000）和全人源GAPDH（1∶2 000）。次日采用TBST洗膜3次，每次10 min。隨后用含辣根過氧化物酶標記的小鼠單克隆抗體（1∶5 000）于室溫下共孵育1 h用TBST洗膜3 次，每次10 min。借助化學發光試劑盒ECL 顯影并與暗室內曝光，采用Image J對其蛋白條帶進行灰度值統計分析。GAPDH作為內參蛋白檢測不同的處理條件下（Con/Decitabine/NOTCH 通路抑制劑/Decitabine+NOTCH 通路抑制劑）的各蛋白表達情況。

1.3 統計學方法

所有數據均采用EXCEL 進行數據錄入，運用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量數據采用均數±標準差（）表示。符合正態分布且方差齊性檢驗合格后，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），與對照組T0組比較采用Dunnett 法分析；不符合則用非參數檢驗進行分析；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲基化探針質量檢測

通過多維定標法確定了1 000 個最易變的位置，顯示了T0 和Tend 之間的差異聚類（圖1A）。在395394探針的樹狀圖中可以直觀地發現JIA患兒的T0和Tend之間的區別（圖1B）為Ⅰ型探針和Ⅱ型探針的結果與甲基化檢測結果完全匹配，其中0 表示未甲基化部分，而其他表示基于β 值的甲基化部分（圖1C），且每個樣品的密度圖表明本研究應用的數據具有較高質量（圖1D）。

圖1 甲基化探針質量檢測

2.2 NOTCH2基因高甲基化導致JIA患兒IL-8表達降低

在圖2A中鑒定出排名前20位的差異甲基化基因，表明Tend 組NOTCH2甲基化水平明顯高于T0組（P＜0.05），而Tend 組中IL-8 的表達水平較T0 組低（圖2B）。以上所有結果表明，經TNF治療后JIA患兒中DNA被高甲基化，且與炎癥相關的基因低表達。而且，被選為靶基因的NOTCH2具有與上述相同的甲基化狀態，而細胞因子IL-8在Tend組中的表達較低，作為后續研究的目標因子。

圖2 甲基化差異基因熱圖情況

2.3 NOTCH2甲基化程度及表達量檢測

本研究通過MSP 以確認樣本中NOTCH2的高甲基化導致其相應的表達水平。Tend 組樣品在NOTCH2中顯示出甲基化程度更高（P＜0.05）（圖3A）。為了選擇合適的濃度，本研究進行了地西他賓濃度篩選，發現地西他賓的最小有效劑量為0.25 μmol/L（圖3B）。證實NOTCH2在Tend組CD4+T細胞系中是高度甲基化的，并且經地西他賓處理后可降低Tend組CD4+T細胞NOTCH2的甲基化水平（圖3C）。RT-qPCR 檢測結果表明，與T0 組相比，在Tend組中CD4+T細胞系的NOTCH2mRNA 表達更明顯，NOTCH2抑制劑處理可下調了該基因的表達（P＜0.05）（圖3D）。WB 檢測結果顯示，Tend 組中NOTCH2蛋白質表達明顯高于T0組，且該現象在施加NOTCH2抑制劑后出現了明顯下調，而地西他賓可逆轉此現象（P＜0.05）（圖3E～3F）。ELISA 檢測結果發現，Tend組中細胞因子IL-8表達水平低于T0組，并且應用NOTCH2抑制劑處理后表達水平明顯升高（P＜0.05）（圖3G）。

圖3 NOTCH2甲基化程度及各處理組表達情況檢測

2.4 NOTCH2抑制劑及脫甲基抑制JIA患兒的細胞活性及細胞周期

MTT檢測結果表明，NOTCH2低表達能夠明顯促進CD4 IL-8 T 細胞增殖（P＜0.05）（圖4A～4B）。由細胞侵襲試驗發現，與空白對照組相比較，Tend組和T0 組中NOTCH2抑制劑處理使侵襲細胞數下降，而Tend 組的遷移能力明顯優于T0 組（P＜0.05）（圖4C～4D）。此外，細胞活力檢測中同樣發現此現象且差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖4E～4F）。

圖4 不同處理組細胞增殖能力及細胞周期情況

2.5 NOTCH 通路抑制劑抑制NOTCH 信號通路并影響細胞因子IL-8和IL-4

兩組NOTCH 通路抑制劑處理可引起的NOTCH通路蛋白表達下調，且與其他3組相比均差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖5A～5B）。此外，地西他賓處理可使IL-8 的表達明顯升高，而NOTCH 通路抑制劑處理可使IL-8 表達明顯下調（P＜0.05），而地西他賓處理可使IL-4的表達明顯下調，而NOTCH 通路抑制劑處理可使IL-4 表達明顯上調（P＜0.05）（圖5C～5D）。

圖5 不同處理組NOTCH2信號通路表達情況及細胞因子變化情況

3 討論

在本研究中，生物信息學分析的結果表明，與T0 組相比，在Tend 組CD4+T 細胞中NOTCH2為高甲基化基因，而Tend組中細胞因子IL-8 mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。應用NOTCH2抑制劑即脫甲基處理后可抑制CD4+T 的細胞增殖。此外，NOTCH 通路抑制劑處理可抑制NOTCH 信號通路并增加細胞因子IL-8表達，同時降低IL-4表達。

DNA甲基化可發生在基因的任何位置，可控制基因表達并維持基因組完整性，從而導致許多生物學過程，例如傷口愈合和纖維化，細胞周期調節，炎癥/應激反應和凋亡[2]。DNA 甲基化具有一種稱為DNA 脫甲基的逆反應，可以由DNA 甲基轉移酶抑制劑地西他賓催化[9]。由于DNA 甲基化與許多生物學進展和疾病密切相關，因此DNA甲基化抑制劑地西他賓對于基于DNA 甲基化以探索這些疾病的發病機理的疾病研究具有重要意義。Cao等[10]指出地西他賓可能通過DNA 甲基化在Ldlr-/-小鼠中的動脈粥樣硬化預防作用而對動脈粥樣硬化的發展產生重大影響。吳萸等[11]的研究證實，MEK抑制劑增強了地西他賓對骨髓增生異常綜合征患者的治療作用。基于此，本研究不僅探討了DNA甲基化對疾病的影響，而且還探討了在抗TNF治療退出之前和之后DNA甲基化對疾病的影響。

有研究顯示腹膜炎患者的流出物中腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑（sTWEAK）水平升高[12]。此外，在細胞之間介導趨化性（趨化性）的趨化因子有兩個主要的亞類，即CC 和CXC[13]。作為促炎性趨化因子，IL-8 通過與CXC 趨化因子受體CXCR1 和CXCR2相互作用而主要吸引嗜中性粒細胞、單核細胞和細胞毒性T 細胞[14]。此外，有研究發現miRK10a 介導的原代內皮細胞中TWEAK 的敲低降低了IL-8和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的產生[15]。

本研究借助生物信息學分析JIA患兒基因組甲基化圖譜，最終選擇了NOTCH2作為目標基因進行進一步的體外研究，并檢測了NOTCH 信號傳導途徑相關蛋白的表達情況，以初步探討NOTCH2引起炎癥的分子機制。有研究發現，NOTCH2可抑制PDGF-B 依賴性增殖，降低PDGF-B 的表達[16]。Huang 等[17]發現NOTCH2途徑和miR-23b 在胃癌細胞的相互調節回路中相互作用，在胃癌發生中起重要作用。Galic 等[18]所述漿液上皮性卵巢癌的低分化組織學可能與NOTCH2表達水平降低有關。而有關NOTCH2在JIA患者中表達的報道較少。本研究發現,在JIA 經抗TNF 治療后NOTCH2高度甲基化。同時，NOTCH2的去甲基化可抑制JIA 患兒CD4+T 細胞的增殖，上調了IL-4 的表達，降低IL-8的表達水平。

本研究的局限性在于所有實驗都是在細胞中進行的，缺乏體內實驗證據，因此我們沒有足夠的結果來確定NOTCH2和JIA 之間的關系。此外，在選擇目標基因和信號通路時，本研究只選擇了一個目標基因和兩個通路，而其他基因或通路未進行檢測。本研究發現NOTCH2對JIA 進展發揮關鍵作用，為臨床JIA 的深入研究和臨床治療提供一個新的思路。