星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對體外循環(huán)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響*

劉國鋒，毛 琦，李 帥，張炳東

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院導(dǎo)管手術(shù)麻醉室，南寧 530021）

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）是利用一系列特殊人工裝置將回心靜脈血引流到體外，經(jīng)人工方法進行氣體交換，調(diào)節(jié)溫度和過濾后，輸回體內(nèi)動脈系統(tǒng)的生命支持技術(shù)，為心內(nèi)直視手術(shù)提供重要保障。然而，由CPB術(shù)后腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率居高不下，其機制尚未清楚，可能與炎癥反應(yīng)、缺血/再灌注、微循環(huán)障礙等有關(guān)[1-2]。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯（stellate ganglion block，SGB）是將局部麻醉藥注射到含有星狀神經(jīng)節(jié)的結(jié)締組織內(nèi)，可逆性地阻斷其節(jié)前及節(jié)后纖維的興奮傳遞而發(fā)生作用，臨床上常用于治療各種疼痛、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）、缺血性腦損傷等引起的功能障礙[3-4]。近年來本課題組及其他學者研究發(fā)現(xiàn)，SGB 對CPB 術(shù)后引起的認知功能障礙有一定的保護作用，其機制可能涉及細胞凋亡和炎癥損傷[5-6]。顱腦局部缺血缺氧易引起細胞凋亡，是引起認知功能障礙的潛在分子機制之一[7]，而細胞凋亡涉及的通路包括死亡受體途徑和線粒體途徑。本研究將SGB應(yīng)用于大鼠CPB腦損傷模型中，探討細胞凋亡可能的途徑及機制，為臨床上SGB應(yīng)用于CPB腦損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；TUNEL 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；通用型SP 免疫組化試劑盒；DAB 顯色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Bax、細胞色素c（Cyt-c）、Caspase-3、β-actin抗體（英國Abcam公司）。

1.2 實驗動物和分組 健康清潔級成年雄性SD大鼠40 只，體重300～320 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（桂）2014-0002。將大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組（S組）、SGB 組、CPB 組、SGB+CPB 組，每組10 只。術(shù)前均禁食8 h，可自由飲水。本研究所有動物實驗均符合倫理委員會要求。

1.3 SGB 和CPB[8]S 組和CPB 組腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行深麻醉，S 組只做動靜脈穿刺。CPB組仰臥位固定于小動物手術(shù)臺上，行氣管插管，用16G動靜脈留置針代替氣管導(dǎo)管連接小動物呼吸機；迅速分離大鼠雙下肢股動脈和右側(cè)頸靜脈，測左側(cè)股動脈的平均動脈壓；從右側(cè)頸靜脈引流靜脈血，經(jīng)過小動物膜式氧合器置換成動脈血，再經(jīng)右側(cè)股動脈灌注重回大鼠體內(nèi)，完成CPB并維持2 h。靜脈注射肝素400 IU/kg，當激活全血凝固時間超過480 s 時開始轉(zhuǎn)流。CPB 總預(yù)充液體約為12 mL，包括5%碳酸氫鈉溶液1 mL、肝素水1 mL（125 U/mL）、乳酸林格溶液4 mL、羥乙基淀粉溶液6 mL，晶體/膠體比例約1∶1。

SGB 組和SGB+CPB 組腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行淺麻醉，從大鼠第7 頸椎棘突進針注射0.25%布比卡因0.2 mL，當大鼠出現(xiàn)明顯的霍納綜合征則表示SGB 模型制備成功。再腹腔注射1%戊巴比妥鈉（10 mg/kg）腹腔注射進行深麻醉，SGB+CPB組建立CPB模型。在CPB期間采用自然降溫和白熾燈照射復(fù)溫的方式控制溫度，S 組和SGB 組大鼠體溫維持在36 ℃及以上，CPB 組和SGB+CPB組體溫維持在34 ℃及以上。

1.4 標本采集 各組大鼠在CPB 2 h 后，迅速斷頭取腦，一部分固定于4%多聚甲醛，另一部分用預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，冰上迅速分離海馬組織，分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 海馬組織HE 染色 取經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h的腦組織，石蠟包埋，切片（5 μm厚），梯度乙醇脫水，二甲苯脫臘及梯度乙醇復(fù)水后，行HE 染色，用中性樹膠封片。每張切片隨機選取5 個視野，顯微鏡下觀察海馬組織病理形態(tài)學改變，拍照。

1.6 TUNEL法檢測海馬組織細胞凋亡 制備腦組織切片，脫臘、梯度乙醇水化、3%H2O2的甲醇溶液處理后，滴加蛋白酶K 工作液、TUNEL 反應(yīng)混合液和DAB 底物染色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。TUNEL 陽性細胞呈棕褐色，即凋亡細胞，正常細胞呈藍紫色。每張切片隨機選取5 個視野，計算凋亡指數(shù)，即TUNEL陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 免疫組化檢測海馬組織Bax 蛋白表達 參照試劑盒說明書步驟，梯度乙醇脫水、抗原修復(fù)、山羊血清封閉，滴加兔抗大鼠Bax多克隆抗體（1∶800），4 ℃孵育過夜；次日滴加山羊抗兔IgG（二抗），DAB顯色。每張切片隨機選擇5個視野計數(shù)，用Image J軟件對免疫組化陽性結(jié)果進行半定量分析。

1.8 Western blotting法檢測海馬組織Cty-C和Caspase-3 蛋白表達 取大鼠海馬組織于離心管中，加入預(yù)冷的組織裂解液，冰浴勻漿，離心，取上清，即為蛋白樣本；BCA 法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳分離蛋白；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗Cty-C、Caspase-3 和βactin 稀釋液（均1∶1 000）4 ℃孵育過夜；洗膜，加入熒光二抗（1∶1 000）室溫下避光孵育1 h；洗膜，Oddsey掃描儀分析灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SGB 可減輕由CPB 引起的大鼠海馬神經(jīng)元損傷 顯微鏡下可見S 組和SGB 組海馬CA3 區(qū)細胞形態(tài)正常，排列大多整齊，邊界清晰，細胞膜完整，細胞核明顯，神經(jīng)元基本結(jié)構(gòu)均正常；CPB 組和SGB+CPB 組海馬神經(jīng)元可見明顯損傷，胞體腫脹透明，彌漫性空泡變性，細胞間排列疏松紊亂，胞核與胞膜之間的界限不清，細胞核溶解消失，部分出現(xiàn)核固縮；與CPB組比較，SGB+CPB組損傷程度減輕，胞體腫脹透明明顯緩解，神經(jīng)元空泡變性的數(shù)量顯著減少，見圖1。

圖1 大鼠海馬組織HE染色圖（×20）

2.2 SGB可減少由CPB引起的海馬神經(jīng)元凋亡 S 組和SGB 組極少見凋亡細胞。CPB 組和SGB+CPB組可見大量凋亡細胞，呈棕褐色。與S組（6.12±1.25）%比較，CPB 組（34.03±3.03）%和SGB+CPB 組（25.38±4.37）%凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.01），而SGB 組（6.15±0.96）%無明顯差異（P＞0.05）；與CPB組比較，SGB+CPB組凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 TUNEL法檢測海馬組織細胞凋亡（×400）

2.3 SGB 可下調(diào)CPB 大鼠海馬神經(jīng)元Bax 蛋白表達 S組和SGB組可見少量淺棕色Bax陽性表達蛋白，CPB 組和SGB+CPB 組可見大量棕褐色Bax 陽性表達蛋白，見圖3。與S 組（0.24±0.04）比較，CPB組（0.49±0.08）、SGB+CPB組（0.36±0.05）Bax蛋白表達量明顯升高（P＜0.05），而SGB 組（0.27±0.05）無明顯差異（P＞0.05）；與CPB 組比較，SGB+CPB 組Bax蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）。

圖3 大鼠海馬組織Bax蛋白表達（SP法，×400）

2.4 SGB可下調(diào)CPB大鼠海馬神經(jīng)元Cyt-c和Caspase-3 蛋白表達 與S 組比較，CPB 組、SGB+CPB組海馬神經(jīng)元Cyt-c和Caspase-3蛋白表達量明顯升高（P＜0.01），而SGB 組無明顯差異（P＞0.05）；與CPB組比較，SGB+CPB組Cyt-c和Caspase-3蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 4組大鼠海馬組織Cyt-c和Caspase-3蛋白表達比較

3 討論

CPB技術(shù)對于大多數(shù)心臟手術(shù)是不可缺少的，但在為心血管外科手術(shù)提供安全可靠保障的同時，由其引起的不良反應(yīng)也日漸增多。在心血管手術(shù)中，一旦建立CPB 技術(shù)，人體將不可避免受到來自多方面損害，包括血液與心肺機和各種管道異物表面接觸、體內(nèi)腸道菌群發(fā)生移位引起敗血癥、器官缺血再灌注引起信號分子級聯(lián)反應(yīng)、抗凝物質(zhì)的使用激活全身補體系統(tǒng)等[9]。CPB術(shù)后的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是由CPB后腦損傷導(dǎo)致的常見問題，并發(fā)癥的主要表現(xiàn)包括認知功能障礙、短暫性腦缺血、卒中及精神異常等。腦損傷的機制至今不明確，缺血性損害、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡可能是其主要原因[10-11]。

細胞凋亡又稱“程序性細胞死亡”，它的本質(zhì)是保持組織器官細胞的恒定生長平衡，清除衰老或異常折疊的細胞。機體正常生理機能情況下如果受到來自細胞內(nèi)外的異常刺激，例如缺血、缺氧、內(nèi)毒素、DNA 損傷等，都會誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。而異常調(diào)控的細胞凋亡多與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如阿爾茨海默病、中風、癌癥等。細胞凋亡的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，文獻綜述將經(jīng)典的細胞凋亡途徑分為外在凋亡途徑（又叫死亡受體途徑）和內(nèi)在凋亡途徑（又叫線粒體途徑）[12]。在大腦損傷疾病中，缺氧缺血激活凋亡的程序基因是造成神經(jīng)元凋亡的主要原因，而缺氧缺血是CPB引起的常見不良反應(yīng)之一[12]。多個動物試驗研究發(fā)現(xiàn)，CPB 可誘發(fā)大鼠腦組織損傷，海馬神經(jīng)元凋亡增多，凋亡指數(shù)增加[13-14]。海馬是CPB 術(shù)后損傷較為嚴重的部位之一，其主要功能與認知和學習記憶能力有關(guān)，說明CPB 術(shù)后引起的認知功能障礙與海馬密切有關(guān)[5]。本研究結(jié)果顯示，CPB 組海馬CA3 區(qū)細胞損傷明顯，HE染色顯示海馬神經(jīng)元腫脹透明，出現(xiàn)彌漫性空泡變性；CPB 組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯高于S組，與上述研究結(jié)果相符。

腦缺血后神經(jīng)元ATP耗竭，由受體介導(dǎo)的死亡信號及促凋亡家族蛋白Bax 可引起線粒體膜孔開放，引起線粒體腫脹、損傷。Caspase-3 與細胞凋亡關(guān)系密切，是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，激活以后可作用于相應(yīng)底物，引起細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)[15]。研究表明，大鼠CPB術(shù)后腦組織內(nèi)Bax和Caspase-3的表達顯著上升[14]。體外試驗發(fā)現(xiàn)采用缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)PC12 細胞，促凋亡蛋白Bax 和Caspase-3 的表達顯著上升[16]。本研究結(jié)果顯示，與S組比較，CPB組海馬神經(jīng)元促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達顯著上調(diào)。Cyt-c 釋放是線粒體凋亡途徑的標志事件。正常生理狀態(tài)下Cyt-c 不能進入細胞，在缺氧/缺血等病理狀態(tài)下，細胞膜通透性增加，Cyt-c 可進入細胞和線粒體發(fā)揮作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CPB 組海馬神經(jīng)元Cyt-c 表達顯著上調(diào)，說明凋亡的線粒體途徑可能是CPB術(shù)后導(dǎo)致的認知功能障礙的機制之一。

SGB 采用局部阻滯頸部交感神經(jīng)節(jié)治療其支配區(qū)域疼痛的經(jīng)典方法。近年研究發(fā)現(xiàn)，SGB能增加腦血液供應(yīng)，改善氧代謝，對缺血性腦損傷產(chǎn)生保護作用[18]。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，SGB 可以改善老年冠狀動脈旁路移植術(shù)后患者的認知功能[19]。SGB可減低家兔全腦缺血再灌注后海馬區(qū)Bax 的表達[20]，還可減輕急性缺氧誘發(fā)的大鼠腦損傷，神經(jīng)元凋亡減少，Bax 表達下調(diào)[21]。本課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)，SGB 能改善CPB 術(shù)后大鼠腦組織灌注以及緩解認知功能障礙[5,8]。本研究中，與CPB 組比較，SGB+CPB組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)明顯減少，Cyt-c、Bax和Caspase-3蛋白表達量明顯降低。說明SGB可明顯減輕由CPB術(shù)后導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷，其機制可能是調(diào)控凋亡的線粒體途徑。

綜上，SGB可通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元凋亡的線粒體途徑，緩解CPB 導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，改善大鼠術(shù)后的認知能力，這將為今后臨床改善患者CPB術(shù)后認知功能障礙提供新的思路和方法。