UPLC-MS聯用同時測定建澤瀉中8種三萜類化學成分

吳雙雙 孫鳳靈 秦 霞 文香月 張亞敏 徐小妹 盧雪花 李麗莎 林文津 徐榕青

福建省醫學科學研究院/福建省醫學測試重點實驗室，福建 福州 350001

澤瀉始載于《神農本草經》，性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效，主要用于高脂血癥、小便不利、泄瀉尿少、水腫脹滿、痰飲眩暈等[1]。澤瀉為常見大宗中藥材，其中產于福建建甌、建陽等地的澤瀉習稱“建澤瀉”。三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降血脂、降血糖、抗癌、抗菌等一系列藥理活性，是澤瀉發揮藥效的物質基礎[2-5]。澤瀉中三萜類成分的常用測定方法有HPLC等[6-7]，同時檢測多種三萜類成分往往用時較長，影響分析效率。UPLC-MS具有分析時間短、分析效率和分析靈敏度高的特點，尤其在同時測定中藥復雜組分方面具有明顯優勢。本文采用UPLC-MS聯用方法同時測定建澤瀉中澤瀉醇A等8種三萜類成分含量，旨在為建澤瀉品質評價提供更準確、靈敏、簡便、可靠的分析手段。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料 建澤瀉植物樣本(采自福建建甌吉陽鎮)，液氮凍存，洗凈，60 ℃烘干后磨粉待用。采集樣本經福建省建甌市吉陽鎮農技站呂竹清鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(sam)juzep.的植株。

1.2 儀器 ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Xevo TQS三重四級桿質譜(美國Waters公司)；電子分析天平(AL204，METTLER TOLEDO(上海))；超聲波清洗器(KQ3200B，昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG- 9070A，上海精宏實驗設備有限公司)；高速多功能粉碎機(TYSP-100，永康市紅太陽機電有限公司)；艾科浦超純水系統(ABZ1-0501-P，頤洋企業發展有限公司)。

1.3 試劑 23-乙酰澤瀉醇B(111846-201504)、甘草次酸(110723-201514)購自中國食品藥品鑒定研究院；澤瀉醇A(19885-10-0)、澤瀉醇B(18649-93-9)、澤瀉醇F(155521-45-2)、澤瀉醇G(155521-46-3)、23-乙酰澤瀉醇C(26575-93-9)、24-乙酰澤瀉醇A(18674-16-3)、24-乙酰澤瀉醇F(443683-76-9)購自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈(色譜純)購自德國 Merck 公司；水為超純水；甲酸為國產分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 采用WatersCORTECSC18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流動相0.1%甲酸水-乙腈，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。梯度洗脫方法為(以乙腈為標準)：1～1.5 min，30%～55%；1.5～5.5 min，55%～75%；5.5～7.5 min，75%～90%；7.5～8.5 min，90%；8.5～8.6 min，90%～30%；8.5～10 min，30%。

2.2 質譜條件 采用電噴霧正離子模式；毛細管電壓3.50 kV；脫溶劑氣流：氮氣800 L/h；脫溶劑溫度500 ℃；錐孔氣流：氮氣150 L/h；離子源溫度：150 ℃；二級錐孔萃取電壓：3.00 V；碰撞氣體：氬氣。

2.3 溶液制備

2.3.1 混合標準品儲備液制備 精密稱取各標準品適量，置于25 mL容量瓶中，加入色譜純乙腈溶液定容，配置成濃度分別為：澤瀉醇A 490 mg/L、澤瀉醇B 520 mg/L、澤瀉醇F 500 mg/L、澤瀉醇G 500 mg/L、23-乙酰澤瀉醇B 490 mg/L、23-乙酰澤瀉醇C 520 mg/L、24-乙酰澤瀉醇A 510 mg/L、24-乙酰澤瀉醇F 530 mg/L混合標準品儲備液。

2.3.2 內標溶液制備 精密稱取甘草次酸標準品，置于25 mL容量瓶中混勻定容成510 mg/L內標儲備液。

2.3.3 樣品溶液制備 稱取建澤瀉樣品粉末約0.5 g置于50 mL錐形瓶中，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補足失重。吸取上清并用0.22 μm的微孔濾膜過濾，將濾液稀釋20倍后與5.1 mg/L的甘草次酸內標溶液1∶1混合得樣品溶液。

2.4 質譜測定方法 本實驗采用正離子多反應監測(MRM)定量模式測定各成分含量，8個分析物及內標的具體質譜分析條件見表1，在對應參數下標準品及樣品中的8個待測成分的出峰情況如圖1所示。

表1 8種待測成分及內標的具體質譜分析參數

注：圖中峰對應的化學成分與表1一致圖1 澤瀉醇A等8種成分的標準品(A)及樣品(B)MRM圖

2.5 標準曲線繪制 吸取混合標準品儲備液和內標儲備液各5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙腈定容。分別吸取上述溶液2 μL、100 μL、200 μL、1 mL、2 mL 于10 mL容量瓶中，加乙腈定容，配成5種含內標系列對照品混合溶液，澤瀉醇A濃度分別為0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L，澤瀉醇B濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,澤瀉醇F濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,澤瀉醇G濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,23-乙酰澤瀉醇B濃度分別為 0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L,23-乙酰澤瀉醇C濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,24-乙酰澤瀉醇A濃度分別為0.0102、0.51、1.02、5.10、10.20 mg/L，24-乙酰澤瀉醇F濃度分別為0.0106、0.53、1.06、5.3、10.6 mg/L。按上述色譜條件、質譜條件及測定方法對含內標系列對照品混合溶液進行測定，并記錄峰面積。以待測成分峰面積與內標物質甘草次酸的峰面積比值(Y)對待測成分濃度(X)作線性回歸，結果如圖2所示，R2均大于0.99。

圖2 澤瀉醇A等8種化學成分線性關系圖

2.6 方法學考察

2.6.1 精密度試驗 精密吸取同一份對照品混合溶液2 μL，在上述色譜質譜條件下連續進樣6次，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內標物的峰面積比值，RSD計算結果見表2，表明精密度良好。

2.6.2 重復性試驗 精密稱取同一批澤瀉樣品6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內標物的峰面積比值并計算含量，RSD計算結果見表2，表明重復性良好。

表2 精密度、重復性及穩定性實驗結果 (n=6)

2.6.3 穩定性試驗 按“2.3.3”項下方法制備1份澤瀉供試品溶液，分別于0、2、6、10、12和24 h進樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內標物的峰面積比值并計算含量，RSD計算結果見表2，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6.4 加樣回收率 精密稱取已知含量的澤瀉樣品6份，每份0.25 g，置于50 mL錐形瓶中，分別精密加入接近等量8種對照品，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補足失重，制備供試溶液。按前述方法測定含量并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.7 樣品含量 測定按上述液相及質譜條件對3批澤瀉塊莖樣品進行測定，并根據回歸方程計算8種待測成分的含量，每批測定3次。結果見表4。

表4 建澤瀉塊莖中8種三萜類成分的含量

續表4 表4 建澤瀉塊莖中8種三萜類成分的含量

3 討論

三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降脂降糖等多種活性，現行版中國藥典以23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C為含量測定指標。澤瀉多種三萜類成分均為澤瀉發揮藥效的重要物質基礎，但不同產地、不同采收期、不同部位及不同炮制方法，澤瀉中三萜類成分有較大差異[7-10]。廣澤瀉中澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇A的含量顯著高于建澤瀉和川澤瀉，川澤瀉中澤瀉醇B、澤瀉醇C等成分的含量顯著高于建澤瀉[11]。以澤瀉醇A24-乙酸酯峰為參照，HPLC指紋圖譜顯示不同產地澤瀉藥材的質量有差異，所含成分的種類與量不完全一致[12]。不同育苗期、移栽期和采收期對川澤瀉三萜類成分均有顯著影響[13]。清炒、麩炒、鹽炙3種炮制方法對澤瀉中澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量均有不同程度影響[14]。以個別的三萜成分為指標評價澤瀉質量具有較大的局限性，同時采用多個三萜類成分作為指標控制澤瀉藥材質量十分必要。

與HPLC相比，UPLC具有更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內保持柱穩定，有利于提高流動相速度，縮短分析時間，提高分析通量。UPLC-MS聯用在同時測定中藥復雜多組分方面具有獨特優勢，并已得到日益廣泛的應用。本實驗建立了同時測定澤瀉中澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F等8種三萜成分的UPLC-MS方法，簡便快捷，靈敏度高，具有良好的重現性和穩定性，結果準確可靠，為澤瀉品質評價及藥材質量控制提供新的分析手段。