醇提聯(lián)合超聲波輔助技術(shù)優(yōu)化黃葵花總黃酮提取工藝研究①

，陳家益，姚玫紅，謝小翠，伍纖纖，楊 淵

(廣西衛(wèi)健委全生命周期健康與保健研究重點實驗室/桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541199)

黃蜀葵[abelmoschus manihot(L.)Medic.]屬錦葵科植物，椐《全國中草藥匯編》記載，黃蜀葵為我國藥食兩用傳統(tǒng)中藥材[1]，具有顯著的臨床療效和營養(yǎng)價值。越來越多的研究者對它的化學(xué)成分測定進(jìn)行廣泛而深入的研究，主要集中于對黃葵花的化學(xué)成分研究[2]。關(guān)于黃葵花的活性成分的研究集中于黃酮類化合物及其單體，包括金絲桃苷、槲皮素、楊梅素、槲皮素-3′-O-β-D-葡萄糖苷、異槲皮苷等[3]。其中，金絲桃苷活性較強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，故選擇它作為黃葵花總黃酮含量測定質(zhì)量控制的指標(biāo)[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃葵花提取物和活性成分具有改善腎功能、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒、保護(hù)心腦缺血損傷、抗氧自由基、抗腫瘤、抗抑郁等多種藥理活性[5]，具有廣闊的開發(fā)前景和研究意義。

迄今為止，對黃葵花總黃酮的提取技術(shù)及方法比較分散，還沒有形成一套系統(tǒng)高效的提取工藝。本研究目的是建立超聲波輔助提取黃葵花總黃酮優(yōu)化參數(shù)。提取過程使用單因素實驗和正交試驗進(jìn)行了優(yōu)化，為后續(xù)黃葵花總黃酮的批量生產(chǎn)、產(chǎn)品開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

黃葵花藥材購于中國安徽省亳州市譙城區(qū)藥材中心中心街112號，石英酶標(biāo)板定制于江蘇省連云港市，金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品(編碼：Q817147-20 mg，純度≥98.0%)購于天津希恩思生化科技有限公司，所有試劑及化學(xué)品均為AR級(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，使用去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技，Varioskan LUS)，超聲清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司，KO-2500E)，高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特，Avanti JXN-26)，循環(huán)水式多用真空泵[上海力辰邦西儀器科技有限公司，SHZ-D(III)]，電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，SQP]，高速多功能粉碎機(jī)(上海頂帥電器有限公司，LD-Y500A)，超純水儀器(廣西南寧市博美生物科技有限公司，Milli-Q Direct)。

1.3 提取程序

1.4 含量測定(改良酶標(biāo)儀比色法)

1.4.1 對照品溶液配制 配制200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密稱取已干燥至恒重的金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品2 mg至10 ml容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度。搖勻即得。

1.4.2 測定波長的選擇 精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液60 μl，供試品溶液30 μl于試管中，分別加乙醇至1 ml，混勻。各取200 μl至石英酶標(biāo)96孔板，搖勻；同時取乙醇200 μl作為空白對照，在200～500 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線，確定其最大吸收波長。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 從200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中分別精密量取0、5、15、25、50、75、100、125、150、175 μl于試管中，加入乙醇至1 ml，混勻。各管取200 μl至石英酶標(biāo)96孔板；同時取乙醇200 μl作為空白對照，于259 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，用除零濃度以外的測定數(shù)據(jù)直接求回歸方程，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 供試樣溶液配制及含量測定 由不同實驗設(shè)計的條件要求，按照1.3項的提取程序得到供試樣。取供試樣溶液10～20 μl于試管中，加乙醇至1 ml，混勻。量取200 μl至石英酶標(biāo)96孔板，同時取乙醇200 μl作為空白對照，在259 nm處測定吸光度，設(shè)置2～3個平行組。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算供試樣品中總黃酮的含量。

1.4.5 精密度實驗 精密吸取供試樣溶液20 μl，按1.4.4項方法測定吸光度，設(shè)計3個平行組。利用酶標(biāo)儀動力學(xué)測量功能模塊，重復(fù)測定6次，計算吸光度值的RSD。

1.4.6 穩(wěn)定性實驗 取由1.3項提取程序制備的供試品溶液，分別于0 h、0.5～1 h、1～2 h、12 h、15 h、1周測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.4.7 回收率實驗 取供試品溶液依次加入4 μg/ml、8 μg/ml和12 μg/ml的金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)液500 μl。然后按1.4.4項方法測量并計算回收率。

1.5 提取工藝優(yōu)化實驗

1.5.1 單因素實驗 采用超聲提取法，對主要影響提取效率的樣篩孔徑(不篩，90～850 μm)、乙醇濃度(50%～90%)、浸泡時長(1～3 h)、料液比(1∶20～1∶120 g/ml)、提取溫度(30～70 ℃)、提取時間(10～50 min)，提取次數(shù)(1～3次)7個因素設(shè)置不同水平，進(jìn)行單因素實驗。

1.5.2 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，篩選出各因素適宜的水平范圍作為正交試驗優(yōu)化的基礎(chǔ)，以總黃酮含量為評價指標(biāo)，采用正交設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)表L18(3)7建立7因素3水平正交試驗組合，見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2 結(jié)果

2.1 黃葵花總黃酮含量測定及驗證

根據(jù)1.4項方法，確定標(biāo)準(zhǔn)品與供試樣品在259 nm處均有最大吸收；在1～35 μg/ml范圍內(nèi)，吸光度與黃葵花總黃酮含量呈良好的線性關(guān)系，線性方程為A=0.04690C+0.06030，r2=0.9978；精密度實驗中OD測量值的RSD均在2%以內(nèi)，表明這種測定方法的精密度良好；穩(wěn)定性實驗中樣品1周內(nèi)總黃酮含量測定結(jié)果的RSD均小于2%，表明供試品溶液在1周內(nèi)穩(wěn)定；回收率實驗中平均回收率大于98%，RSD為0.012%，表明該法符合含量測定要求。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 樣篩孔徑對總黃酮提取率的影響 由結(jié)果圖1(A)可知，隨著樣篩孔徑的減小，黃葵花總黃酮的提取量逐漸增加。當(dāng)樣篩孔徑為90 μm時，總黃酮提取量最高；以不篩的粉末為對照，不篩的比樣篩孔徑為850 μm、250 μm時提取得到總黃酮含量要高，比樣篩孔徑為150 μm、90 μm時的低。因此，選擇不篩、樣篩孔徑為150 μm、90 μm的黃葵花粉末進(jìn)一步優(yōu)化研究。

2.2.2 料液比對總黃酮提取率的影響 如圖1(B)所示，隨著料液比的減小，總黃酮含量逐漸增加。當(dāng)料液比減少到1∶80 g/ml之后，所測得總黃酮含量趨于穩(wěn)定或略微減少，可見黃葵花中的總黃酮已被提取完全。故后續(xù)實驗中的料液比優(yōu)化在 1∶60 g/ml和 1∶100 g/ml 之間。

2.2.3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 乙醇作為最環(huán)保的溶劑之一，具有經(jīng)濟(jì)性、安全性和可持續(xù)性[6]。因此，選擇乙醇作為提取溶劑。如圖1(C)所示，黃葵花總黃酮的提取量隨著乙醇濃度的增大而增加。在70%乙醇時觀察到總黃酮最大產(chǎn)量，總黃酮含量隨著乙醇濃度的進(jìn)一步增大而減少。因此，后續(xù)實驗乙醇濃度選擇在60%～80%之間優(yōu)化。

2.2.4 浸泡時長對總黃酮提取率的影響 研究浸泡時長對黃葵花總黃酮的影響，結(jié)果見圖1(D)，浸泡時長為2 h時黃酮含量達(dá)到峰值，然后出現(xiàn)下降的趨勢。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，后續(xù)實驗中浸泡時長在1～3 h之間優(yōu)化是最佳的。

2.2.5 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響 測定不同提取次數(shù)對黃葵花總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖1(E)，總黃酮含量在提取2次時基本達(dá)到最大值，綜合考慮生產(chǎn)需求，后續(xù)實驗提取次數(shù)優(yōu)化在1～3次之間是最理想的選擇。

圖1 不同參數(shù)對總黃酮提取率的影響(A) 樣篩孔徑對總黃酮提取率的影響；(B) 料液比對總黃酮提取率的影響；(C) 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響；(D)浸泡時長對總黃酮提取率的影響；(E)提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響；(F)溫度對總黃酮提取率的影響；(G) 提取時間對黃葵花總黃酮提取率的影響

2.2.6 提取溫度對總黃酮提取率的影響 如圖1(F)所描繪，提取溫度在30 ℃～50 ℃之間總黃酮提取率逐漸增加至峰值。但當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時，總黃酮的提取率降低。因此，后續(xù)實驗選擇40 ℃～60 ℃之間的提取溫度進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.7 提取時間對總黃酮提取率的影響 由圖1(G)可知，在 10～30 min之間，總黃酮的提取率隨時間增加而增加，并且達(dá)到峰值。但是隨著超聲提取時間的繼續(xù)延長，提取率逐漸降低。考慮到節(jié)約時間及能源，后續(xù)實驗選擇提取時間優(yōu)化在20 min～40 min之間。

2.3 正交試驗及驗證

正交試驗方案及結(jié)果見表3，根據(jù)極差R值，各因素對總黃酮提取率的影響順序為樣篩孔徑、提取次數(shù)、提取時間、浸泡時長、料液比、乙醇濃度、提取溫度。最佳工藝組合為A3B3C1D2E3F3G1，即樣篩孔徑90 μm，料液比1∶100，乙醇濃度60%，浸泡時長2 h，提取次數(shù)3次，提取溫度60 ℃，提取時間20 min。根據(jù)表4所示的方差分析結(jié)果，樣篩孔徑、浸泡時長、提取次數(shù)、提取時間是顯著影響因素(P<0.05)。

按照正交設(shè)計篩選出的最優(yōu)工藝，進(jìn)行3次平行驗證試驗，得到總黃酮在黃葵花中的平均含量為6.807%，RSD為0.007%，表明該工藝穩(wěn)定，合理可行。

表3 正交試驗方案及結(jié)果

表4 正交試驗方差分析

3 討論

到目前為止，多種提取技術(shù)已被用于黃葵花黃酮化合物的提取。如索氏回流、加熱回流[7]，超聲提取[8]，改良超臨界二氧化碳萃取[9]，但黃葵花提取工藝以傳統(tǒng)的乙醇加熱提取為主。超聲波輔助提取是新型、綠色的技術(shù)，通過超聲波輻射溶液產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)等作用，瞬時破壞藥材細(xì)胞壁，增強(qiáng)溶劑滲透作用[10]，具有省時、高效、簡單的優(yōu)勢。

根據(jù)驗證試驗結(jié)果，確定改良酶標(biāo)儀比色-不顯色法[11]測定黃葵花總黃酮的含量可行，該方法比紫外-可見分光光度法操作簡單，線性范圍良好[12]，與HPLC法一樣可準(zhǔn)確定量測定，并且效率高，更適合大量樣品的檢測[13]。高貫威等[14]也報告了基于某種比色法應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行活性物質(zhì)測定的類似研究。

正交試驗應(yīng)用正交原理和數(shù)理統(tǒng)計，通過最少的實驗次數(shù)選出較優(yōu)條件的組合，應(yīng)用于中藥提取活性物質(zhì)的條件優(yōu)化中[15]。正交試驗表明樣篩孔徑、浸泡時長、提取次數(shù)、提取時間在醇提聯(lián)合超聲正交優(yōu)化實驗中對黃葵花總黃酮溶解度影響更顯著。①樣篩孔徑：樣篩孔徑越小，能夠濾過的粒徑越小，黃葵花總黃酮溶解度亦越大。根據(jù)Mai等[16]的說法，黃酮類化合物含量隨著粒徑的減小而顯著增加，具有更大表面積的更細(xì)顆粒會加速黃酮類化合物從樣品基質(zhì)中溶解直至飽和。②浸泡時長：物質(zhì)完全溶解于溶劑需要一定時間[17]，浸泡時間越長，越有利于黃葵花總黃酮的溶解，直至完全溶解至飽和。然而浸泡時間過長后，其他雜質(zhì)也溶解，會影響總黃酮的溶解度。③提取次數(shù)：隨著超聲提取次數(shù)的增加，黃酮類物質(zhì)逐漸被溶解出來。提取到一定次數(shù)時，黃葵花中的總黃酮已經(jīng)基本被溶出，繼續(xù)增加提取次數(shù)，總黃酮的得率不會明顯提高，相關(guān)研究中也報告提取次數(shù)和提取率之間的類似關(guān)系[18]。④提取時間：提取過程中細(xì)胞內(nèi)外總黃酮的濃度在一定時間前沒達(dá)到平衡，隨著提取時間的增加，總黃酮逐漸溶解到平衡狀態(tài)。如果繼續(xù)延長提取時間，會導(dǎo)致總黃酮長時間暴露在超聲波下易降解[16]。

本研究結(jié)果表明，超聲輔助技術(shù)可作為從黃葵花中提取總黃酮的有效方法。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對提取變量進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)樣篩孔徑、浸泡時長、提取次數(shù)、提取時間是影響黃葵花總黃酮提取率的關(guān)鍵因素，并確定了最佳提取參數(shù)。此外，應(yīng)用酶標(biāo)儀比色法優(yōu)化了黃葵花總黃酮含量測定，為黃葵花總黃酮相關(guān)產(chǎn)品精深開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。