中國南海軟珊瑚共附生真菌Emericellopsis sp. SCSIO41202的次級代謝產(chǎn)物研究

，楊 斌，李慧敏，付春鈺，劉永宏，李云秋

(桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 541199)

地球表面積占比最多的是海洋，擁有豐富的生物資源。近年來，海洋微生物作為候選藥物新來源備受關注[1]。海洋真菌作為最為典型的海洋微生物，是產(chǎn)生具有獨特結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物的豐富來源之一，同時也被公認為藥物候選開發(fā)的前沿資源。海洋環(huán)境的獨特特征(如高鹽、高壓、缺氧和光照條件)，導致海洋真菌能夠產(chǎn)生不同于陸地微生物的次級代謝產(chǎn)物[2]。因此，來源于海洋的真菌被研究人員認為是尋找新藥最重要的資源[3]。

珊瑚組成的生態(tài)系統(tǒng)中生活著豐富多樣的真菌，其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有廣泛的生物活性， 如抗菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒和抗污損等[4-5]。Zubair等[6]從珊瑚sarcophytontrocheliophorum中分離得到sarcotrocheliol acetate和sarcotrocheliol對金葡菌、鮑曼不動桿菌屬和耐甲氧西林金葡菌抗菌活性較強。Zheng等[7]從軟珊瑚Alternariasp. ZJ-2008003中分離得到的Tetrahydroaltersolanol C和alterporriol Q能夠抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，alterporriol P對PC-3和HCT-116細胞系具有抑制作用。

本論文通過對來源于南海海洋軟珊瑚中分離得到的一株翅孢殼屬真菌Emericellopsissp. SCSIO41202進行次級代謝產(chǎn)物的研究。經(jīng)鑒定該株真菌與Emericellopsissp. GYJ3(1)(KM268654)有99%的同源性。從獲得浸膏中獲得大豆苷元(1)、5-甲氧基大豆苷元(2)、染料木素(3)、(3R，4S)-6，8-二羥基-3，4-二氫-3，4，5，7-四甲基異香豆素(4)、(3R，4R)-4-乙酰基-3，4-二氫-6，8-二羥基-3-甲氧基-5-甲基異香豆素(5)、(3S，4S)-4-乙酰基-3，4-二氫-6，8-二羥基-3-甲氧基-5-甲基異香豆素(6)、煙曲霉酸(7)、1H-吲哚-3-甲醛(8)，共8個化合物。這些化合物均為從真菌Emericellopsissp. SCSIO41202中首次分離得到。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：微生物生物安全柜(ESCO型)，C615/605型中壓色譜，半制備HPLC(Hitachi Primade型)，EYELAN-1100V-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，核磁共振(AV-700型)。試劑：TLC硅膠板(青島化工廠)，硅膠(Merck公司)，乙酸乙酯，丙酮等分析純(廣州大茂化學試劑有限公司)等。

1.2 菌株發(fā)酵與培養(yǎng)

菌株通過DNA擴增和ITS區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較鑒定為翅孢殼屬(Emericellopsissp.)編號SCSIO41202，與Emericellopsissp. GYJ3(1)(KM268654)有99%的同源性。

將該菌株接種到馬鈴薯粉固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中活化1周，溫度為28 ℃。將活化成功的菌株接種到150 ml三角燒瓶中，瓶中含有35 ml MB培養(yǎng)液(麥芽粉30 g，海鹽5.0 g，蒸餾水2 000 ml，pH=7.4～7.8)，搖床(180 r/min，25 ℃)培養(yǎng)3/d。將所得的種子液依次接種至液體培養(yǎng)基(麥芽粉20 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉1 g/L，硫酸銨5 g/L，pH 6.0)中，共30瓶，同樣搖床條件下培養(yǎng)2周。

1.3 提取分離純化

菌株發(fā)酵結(jié)束后，每瓶發(fā)酵產(chǎn)物各加入兩倍體積的乙酸乙酯浸泡、破碎機破碎、超聲40 min，共萃取3次，濃縮后得到乙酸乙酯粗浸膏。將獲得的浸膏用硅膠拌樣，選擇正相中壓柱，按梯度進行洗脫(石油醚/乙酸乙酯：100∶0 ～ 1∶1，流速為50 ml/min；石油醚/乙酸乙酯/甲醇：9∶9∶1 ～ 0∶0∶100，流速為50 ml/min)。通過TLC檢識以及液相紫外吸收圖合并得3個餾分。其中Frs.1經(jīng)ODS反相色譜梯度洗脫(VMeOH∶VH2O=3∶97 ～ 100∶0)得到21個子餾分，F(xiàn)rs.1-12經(jīng)HPLC(VMeOH∶VH2O=45∶55)分別得化合物1(5.04 mg)和化合物2(2.59 mg)，F(xiàn)rs.1-13經(jīng)HPLC(VMeOH∶VH2O=46∶54)分離出化合物3(2.28 mg)，F(xiàn)rs.1-8經(jīng)HPLC(VMeOH∶VH2O=45∶55)分離出化合物4(6.43 mg)，F(xiàn)rs.1-16經(jīng)HPLC(VMeOH∶VH2O=60∶40)分離出化合物7(3.46 mg)，F(xiàn)rs.1-9經(jīng)HPLC(VMeOH∶VH2O=35∶65)分離出化合物8(5.11 mg)；其中Frs.2經(jīng)ODS反相色譜梯度洗脫(VMeOH∶VH2O=3∶97 ～ 100∶0)得到16個子餾分，F(xiàn)rs.2-10經(jīng)HPLC(VMeOH∶VH2O=40∶60)分別得到兩種對映異構(gòu)體，為化合物5(4.82 mg)和化合物6(3.64 mg)。化合物1～8結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1～8結(jié)構(gòu)

2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色油狀物，1H-NMR(700 MHz， MEOD)δH： 8.09(1H， s， H-2)， 8.00(1H， d， J=8.8 Hz， H-5)， 7.36(2H， m， H-2′， 6′)， 6.88(1H， dd，J=8.8HZ， 2.2Hz， H-6)， 6.84(2H， m， H-3′， 5′)， 6.76(1H， t，J=1.7 Hz， H-8)；13C-NMR(700 MHz， MEOD)δC： 154.4(CH， C-2)，125.7(C， C-3)， 178.2(C， C-4)， 128.2(CH， C-5)， 117.81(CH， C-6)， 167.7(C， C-7)， 103.5(CH， C-8)， 160.2(C， C-9)， 117.0(C， C-10)， 124.5(C， C-1′)，131.4(CH， C-2′，6′)， 116.2(CH， C-3′，5′)， 158.6(C， C-4′)。本研究數(shù)據(jù)和文獻核磁數(shù)據(jù)[8]比對基本相同，所以鑒定為大豆苷元(daidzein)。

2.2 化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色油狀物，1H-NMR(700 MHz， MEOD)δH： 7.98(1H， s， H-2)， 7.36(1H， s， H-6)， 7.36(2H，m，H-2′， 6′)， 6.83(2H， d，J=8.6HZ， H-3′， 5′)， 6.56(1H， s， H-8)， 3.87(3H， s， OCH3)；13C-NMR(700 MHz， MEOD)δC： 153.1(CH， C-2)，125.4(C， C-3)， 177.6(C， C-4)， 152.6(C， C-5)， 103.2(CH， C-6)， 166.3(C， C-7)， 103.8(CH， C-8)， 157.0(C， C-9)， 113.1(C， C-10)， 124.9(C， C-1′)，131.5(CH， C-2′，6′)， 116.1(CH， C-3′，5′)， 158.4(C， C-4′)。本研究數(shù)據(jù)和文獻核磁數(shù)據(jù)[9]比對基本相同，所以鑒定為5-甲氧基大豆苷元(methoxydaidzein)。

2.3 化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色油狀物，1H-NMR(700 MHz， MEOD)δH： 8.01(1H， s， H-2)， 6.17(1H， d，J=2.1 Hz， H-6)， 7.36(2H， m， H-2′， 6′)， 6.84(2H， m， H-3′， 5′)， 6.27(1H， t，J=1.1 Hz， H-8)；13C-NMR(700 MHz， MEOD)δC： 154.5(CH， C-2)，123.5(C， C-3)， 182.0(C， C-4)， 163.7(C， C-5)， 100.9(CH， C-6)， 168.4(C， C-7)， 95.4(CH， C-8)， 159.9(C， C-9)， 105.6(C， C-10)， 124.6(C， C-1′)，131.4(CH， C-2′，6′)， 114.6(CH， C-3′，5′)， 158.8(C， C-4′)。本研究核磁數(shù)據(jù)和文獻數(shù)據(jù)[8]比對基本相同，所以判斷為染料木素。

2.4 化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色油狀物；1H-NMR(700 MHz， MEOD)δH： 11.49(1H， s， OH-8)， 6.53(1H， s， OH-6)， 4.66(1H， qd，J=6.7， 1.1 Hz， H-3)， 3.05(1H， qd，J=7.1， 1.0 Hz， H-4)， 2.09(3H， s， Me-7)， 2.06(3H， s， Me-5)， 1.25(6H， dd，J=11.9， 6.9 Hz， Me-3，4)；13C-NMR(700 MHz， MEOD)δC： 169.4(C=O， C-1)，81.6(CH， C-3)， 35.6(CH， C-4)， 115.1(C， C-5)， 162.5(C， C-6)， 110.4(C， C-7)， 161.4(C， C-8)， 140.8(C， C-4a)， 99.6(C， C-8a)， 8.2(CH3， C-9)，10.7(CH3， C-10)， 19.9(CH3， C-11)， 20.1(CH3， C-12)。本研究數(shù)據(jù)和文獻核磁數(shù)據(jù)[10]比對基本相同，所以鑒定為(3R，4S)-6，8-二羥基-3，4-二氫-3，4，5，7-四甲基異香豆素。

2.5 化合物5的結(jié)構(gòu)鑒定

粉紅色粉末，1H-NMR(700 MHz， MEOD)δH：5.72(1H， d，J=1.3 Hz， H-3)， 4.31(1H， d，J=1.3 Hz， H-4)， 6.33(1H， s， H-7)， 3.53(3H， s， H-11)， 2.18(3H， s， H-13)， 2.03(3H， s， H-14)；13C-NMR(700 MHz， MEOD)δC： 169.3(C=O， C-1)，103.2(C， C-3)， 54.8(C， C-4)， 117.4(C， C-5)， 165.1(C， C-6)， 102.3(CH， C-7)， 163.7(C， C-8)， 101.0(C， C-9)， 136.1(C， C-10)， 57.1(OCH3， C-11)，204.5(C=O， C-12)， 29.1(CH3， C-13)， 11.1(CH3， C-14)。本研究數(shù)據(jù)和文獻核磁數(shù)據(jù)[11]比對基本相同，所以鑒定為(3R，4R)-4-乙酰基-3，4-二氫-6，8-二羥基-3-甲氧基-5-甲基異香豆素。

2.6 化合物6的結(jié)構(gòu)鑒定

粉紅色粉末，1H-NMR(700 MHz， MEOD)δH： 5.54(1H， d，J=3.6 Hz， H-3)， 4.51(1H， d，J=3.6 Hz， H-4)， 6.33(1H， s， H-7)， 3.65(3H， s， H-11)， 2.26(3H， s， H-13)， 2.00(3H， s， H-14)；13C-NMR(700 MHz， MEOD)δC： 170.4(C=O， C-1)，104.4(C， C-3)， 53.9(C， C-4)， 116.7(C， C-5)， 164.8(C， C-6)， 102.6(CH， C-7)， 163.7(C， C-8)， 101.6(C， C-9)， 136.6(C， C-10)， 58.0(OCH3， C-11)，204.6(C=O， C-12)， 31.9(CH3， C-13)， 10.8(CH3， C-14)。本研究數(shù)據(jù)和文獻核磁數(shù)據(jù)[11]比對基本相同，所以鑒定為(3S，4S)-4-乙酰基-3，4-二氫-6，8-二羥基-3-甲氧基-5-甲基異香豆素。

2.7 化合物7的結(jié)構(gòu)鑒定

白色粉末，1H-NMR(700 MHz， DMSO)δH： 7.40(1H， d，J=10.0 Hz， H-1)， 5.75(1H， d，J=10.0 Hz， H-2)， 2.73(1H， dt，J=13.6， 6.7 Hz， H-4)， 3.31(1H， s， H-5)， 5.10(1H， ddt，J=8.8， 7.3， 1.5 Hz， H-6)， 2.62(1H， dt，J=12.6， 2.5 Hz， H-9)， 1.97(1H， m， H-11a)， 1.60(1H， d，J=14.4 Hz， H-11b)， 2.30(1H， dt，J=11.9， 6.2 Hz， H-12a)， 1.71(1H， qd，J=12.4， 3.6 Hz， H-12b)， 2.51(1H， d，J=7 Hz， H-13)，2.26(1H， m， H-15a)， 1.90(1H， m， H-15b)， 5.63(1H， d，J=8.4 Hz， H-16)， 0.79(3H， s， H-18)， 1.37(3H， s， H-19)， 2.39(2H， m， H-22)， 2.13(1H， m， H-23a)， 2.07(1H， s， H-23b)， 5.03(1H， d，J=1.3 Hz， H-24)， 1.56(3H， s， H-26)， 1.64(3H， s， H-27)， 1.11(3H， d，J=6.8 Hz， H-28)， 1.09(3H， s， H-29)， 1.87(3H， s， H-31)， 2.07(3H， s， H-33)；13C-NMR(700 MHz， DMSO)δC： 158.5(CH， C-1)， 126.9(CH， C-2)， 200.9(C=O， C-3)， 40.0(CH， C-4)， 48.0(CH， C-5)，73.1(CH， C-6)， 209.3(C=O， C-7)， 52.3(C， C-8)， 41.2(CH， C-9)， 37.7(CH， C-10)， 23.2(CH2， C-11)， 25.5(CH2， C-12)， 46.1(CH， C-13)， 45.6(CH， C-14)， 40.4(CH2， C-15)， 73.1(CH， C-16)， 144.3(CH， C-17)， 17.6(CH3， C-18)， 27.2(CH3， C-19)， 131.1(C， C-20)， 171.1(C=O， C-21)， 29.3(CH2， C-22)， 28.0(CH2， C-23)， 123.3(CH， C-24)， 37.7(C， C-25)， 17.7(CH3， C-26)， 25.4(CH3， C-27)， 12.3(CH3， C-28)， 17.7(CH3， C-29)， 169.1(C=O， C-30)， 20.4(CH3， C-31)， 169.7(C=O， C-32)， 20.5(CH3， C-33)。本研究數(shù)據(jù)和文獻核磁數(shù)據(jù)[12]比對基本相同，所以鑒定為煙曲霉酸。

2.8 化合物8的結(jié)構(gòu)鑒定

白色粉末，1H-NMR(700 MHz， MEOD)δH： 8.10(1H， s， H-2)， 8.15(1H， dd，J=7.6， 1.3 Hz， H-4)， 7.24(1H，dd，J=8.3， 7.9 H-5)， 7.28(1H， dd，J=8.3， 7.1， H-6)， 7.48(1H， d，J=8.1 Hz， H-7)， 9.89(1H， s， H-8)；13C-NMR(700 MHz， MEOD)δC： 169.3(C=O， C-8)， 139.7(CH， C-2)， 133.6(C， C-3)，125.7(C， C-3a)， 122.4(CH， C-4)， 123.6(CH， C-5)， 125.0(CH， C-6)， 113.1(CH， C-7)， 138.9(C， C-7a)。本研究數(shù)據(jù)和文獻核磁數(shù)據(jù)[13]比對基本相同，所以鑒定為1H-吲哚-3-甲醛。

3 酶抑制活性分析

對化合物1～8在50 μg/ml濃度下對乙酰膽堿酯酶(AChE)和胰脂肪酶(PL)的抑制作用進行評價。實驗結(jié)果顯示，化合物1、3、6、7、8對AChE具有抑制作用，其中化合物3、7對PL也有抑制作用，而化合物7的抑制作用較強，見表1。

表1 化合物1～8對胰脂肪酶和乙酰膽堿酯酶的抑制活性

4 討論

本文通過對中國南海軟珊瑚來源共附生真菌Emericellopsissp. SCSIO41202的次級代謝產(chǎn)物的研究，共分得8個單體已知化合物：3個異黃酮類，3個異香豆素類，1個庚酸類以及1個單吲哚類生物堿。據(jù)相關文獻報告，異黃酮類化合物表現(xiàn)出顯著的α-葡萄糖苷酶抑制作用[14]，同時，對于DPPH自由基具有較強的清除作用[15]。其中化合物1大豆苷元具有顯著的抗心血管疾病、解痙和抗癌作用[16]。化合物3染料木素已被證明與順鉑和多西紫杉醇具有協(xié)同作用，能夠增強對BxPC-3胰腺癌細胞的抗增殖作用[17]。化合物7煙曲霉酸對能夠明顯抑制B.subtilis以及MRSA活性，MIC值分別為2 μg/mL，4 μg/mL[18]。本研究中，化合物1、3、6、8對AChE和PL均有抑制作用，而化合物7抑制作用較強，達到41.7%。

經(jīng)多項研究表明，該真菌Emericellopsis sp. SCSIO41202屬于嗜堿性真菌，能夠產(chǎn)生的多種類的次生代謝產(chǎn)物，化學活性多樣。本文豐富了南海海洋軟珊瑚中對于嗜堿性真菌Emericellopsis sp.次生代謝產(chǎn)物的研究，也說明了此翅孢殼屬真菌中產(chǎn)出獨特新穎結(jié)構(gòu)與活性的巨大優(yōu)勢，是后續(xù)研究者在挖掘和研究先導化合物中值得關注的重點領域之一。