結直腸癌患者Kras基因突變與分化程度及組織類型的相關性研究①

，王海鵬 ，朱襲嘉，李盛國，蔣世宇，張琪琦

(桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西 桂林 54199)

結直腸癌，是腸道高發(fā)的惡行腫瘤之一，通常侵襲大腸，通常以腸壁息肉開始[1]，是男性第三大常見癌癥，女性第二常見癌癥。KRAS基因是與人類腫瘤相關的RAS基因家族的成員。因為RAS蛋白編碼為21 kD[2]，所以，KRAS也被稱為p21基因。目前，已經有多個研究表明，在結直腸癌患者中，KRAS基因的突變率最高[3]，且在女性、中高分化患者中的突變率更高[4-5]。KRAS的第二號外顯子突變存在于45%的結直腸癌中，涉及到腫瘤的發(fā)生、增殖和進展及預后[6]。 KRAS的其他外顯子突變、NRAS等突變也占了10%的比例。 臨床研究證實，不論是西妥昔單抗、帕尼單抗，還是厄洛替尼、吉非替尼，都未能讓RAS突變的腸癌患者從EGFR靶點的靶向治療中受益。基于此，本研究分析結直腸癌患者的KRAS基因的突變情況及其潛在突變位點，為結直腸癌患者診療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2020年7月于桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院確診為結直腸癌患者89例，其中有26 例KRAS突變陽性患者，將其納入突變組；63 例KRAS突變陰性患者，將其納入未突變組。

納入標準：①術后病理學確診為結直腸癌；②術前檢查后 1 周內接受根治性手術治療，淋巴清掃至腸系膜血管根部，腸系膜下動脈選擇根部離斷或保留左結腸動脈分支后離斷，直腸遠切緣距腫瘤至少2 cm；③腫瘤邊緣≥5 cm行KRAS基因檢測。

排除標準：①有原發(fā)性直腸癌外的其他腹盆腔疾病或相關血管相關疾病(如門靜脈高壓、血管狹窄、血栓或發(fā)育變異)；②合并嚴重糖尿病、高血壓、感染者；合并腎、心、肝、肺等臟器功能嚴重障礙者及患有其他惡性腫瘤患者；③臨床資料不完整。

本研究經桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準后執(zhí)行。

1.2 方法

采用熒光定量PCRTaqman-ARMS探針法測定K-ras基因突變。①總RNA提取：將Trizol裂解組織的混合液收集至滅菌的1.5 ml EP管中，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min，吸取上清液至另一滅菌的1.5 ml EP管中，并加入200 μl氯仿，蓋緊管蓋，劇烈充分震蕩15～30 s，至乳化充分，無分相現象。室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min，于上清液中加入500 μl異丙醇，并蓋緊管蓋，正反顛倒EP管，混勻。室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min。最后，去除EP管，仔細觀察管底部是否有微小的白色沉淀，此即總RNA。②用75 %乙醇洗滌RNA，去除上清液，小心沿管壁加入75 %乙醇1 ml/管，輕輕上下翻動EP管，使沉淀從管壁脫落，4 ℃、12 000 r/min、離心5 min，去除上清液，以濾紙吸干管口乙醇，開蓋晾干。加入DEPC水30 μl/管，溶解RNA，用紫外分光光度計測定OD260與OD280，并計算OD260與OD280比值，篩選比值在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實驗。RNA濃度計算：RNA濃度(μg/μl)=(OD260×40×稀釋倍數)/1 000。③配置RT-PCR反應液及瓊脂糖凝膠：首先安裝好制膠架和梳子，然后秤取瓊脂糖1.5 g，用100 ml電泳緩沖液溶解，微波爐中加熱2 min至沸騰，取出后冷卻至50 ℃左右，加入緩沖液，調節(jié)終濃度為0.5 μg/ml，最后將加入染料的瓊脂糖凝膠傾倒入制膠架內，室溫凝固20 min，垂直拔掉梳子，將瓊脂糖凝膠轉移至水平電泳槽內，加入電泳緩沖液，使液面與凝膠面齊平，梳子孔中充滿電泳緩沖液。將擴增產物按照5∶1加入6×上樣緩沖液，混勻，每孔加入5 μl進行電泳。電泳儀參數設定為80 V、60 min，恒壓電泳，電泳過程中隨時觀察溴酚藍電泳位置，跑至凝膠邊緣立即停止電泳。④測序反應及純化：向新的0.2 ml的EP管中加測序試液1 μl、酶解產物2 μl和引物2 μl 進行 PCR 擴增，擴增條件為96 ℃、1 min循環(huán) 1 次，96 ℃、10 s，50 ℃、5 s，60 ℃、2 min循環(huán) 25 次，25 ℃、1 min循環(huán)1 次。加醋酸鈉-乙醇混合物16 ul(醋酸鈉∶乙醇=1∶15)并劇烈震蕩，避光靜置15 min后4 ℃、12 000 r/min、離心30 min，去除上清液，加預冷70 %乙醇70 μl，劇烈震蕩，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min后去除上清液。顛倒數次混勻后4 ℃、12 000 r/min、離心5 min后去除上清液。再次加預冷70 %乙醇70 μl，顛倒數次混勻后4 ℃、12 000 r/min、離心5 min后去除上清液，室溫放置30 min讓酒精揮發(fā)干凈，加入去離子甲酰胺溶解DNA。⑤PCR儀變性：95 ℃、4 min，4 ℃、4 min。向96孔板內移液，每孔加11 μl，避免孔內出現氣泡。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 突變組與未突變組一般資料均一性檢驗

突變組和未突變組的年齡分別為(57.12±8.40)歲、(58.71±9.02)歲；突變組26例，男12例，女14例；未突變組63例，男31例，女32例；突變組BMI(23.81±2.09 kg/m2)，未突變組BMI(58.71±9.02 kg/m2)；突變組病變部位：結腸癌18例，直腸癌8例；未突變組病變部位：結腸癌39例，直腸癌24例。比較突變組與未突變組臨床一般資料無顯著的統(tǒng)計學差異(P>0.05)，資料有較好的可比性，見表1。

表1 一般資料均一性比較

2.2 KRAS基因突變與組織學類型的相關性分析

分析KARS基因突變與組織學類型的關系，發(fā)現突變組腺癌比例(80.77%)顯著高于未突變組腺癌比例(44.44%)，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。此外，分析腫瘤分化程度和KARS基因突變的關系，發(fā)現高分化、中分化和低分化的程度和突變與否有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，在突變組中中分化的比例較高，見表3。

表2 兩組不同組織學類型結直腸癌組織中KRAS基因突變分析(n，%)

表3 兩組不同分化程度結直腸癌組織中KRAS基因突變分析(n，%)

3 討論

結直腸癌是腸道高發(fā)的惡性腫瘤之一，也是繼肺癌之后人類最高發(fā)的癌癥種類[7]，在世界范圍以北美洲及大洋洲地區(qū)多發(fā)，在我國東南沿海地區(qū)常見。結直腸癌的發(fā)生發(fā)展與很多基因相關，如KRAS基因、RAS基因等。各種基因共同或單獨作用，影響結直腸癌的進程，如KRAS和PIK3CA雙突變與侵襲性臨床病理特征顯著相關[8]。CRC患者糞便中BRAF V600E突變及KRAS突變與腫瘤的位置、組織病理及分化程度也有顯著關系[9]。KRAS蛋白為單聚體G蛋白，其磷酸化可導致PI3K-PDK1-PKB和RAF-MEK-MRK1/2信號通路的激活，一般認為KRAS突變是結直腸癌形成的早期。有研究已證實，β-catenin和Cyclin D1兩種蛋白在KRAS突變型結直腸癌樣本中的表達水平非常高，且抑制β-catenin表達后KRAS突變型結直腸癌細胞的增殖也降低，這促進了細胞的凋亡[10]。也有研究表明，KRAS基因突變與性別、分化程度有關，NRAS基因突變與分化程度、腫瘤類型有關[4]。而結直腸癌中hMSH2表達缺失對KRAS基因突變也有一定影響[11]。KRAS基因突變不僅可以為診斷結直腸癌提供幫助，也會影響EGFR抑制劑在臨床上的作用，用KRAS StripAssay檢測結直腸癌患者KRAS突變是一種新型的有效方法[12]。

KRAS基因突變的結直腸癌患者中，約85%～90%的突變集中在第2號外顯子的12、13密碼子上[13]，其余突變中約5%發(fā)生在61密碼子上，5%發(fā)生在146外顯子上[14]。KRAS基因突變與PD-L1表達有相關性[15]。研究表明，有28.7%的CRCs存在密碼子12和13的KRAS突變，密碼子12上甘氨酸-天門冬氨酸突變(p.G12D)和密碼子13上甘氨酸-天門冬氨酸突變(p.G13D)是最常見的突變類型[16]。相關研究結果顯示，KRAS基因在結直腸癌中患者的突變率為20%～50%[5]。也有相關文獻報告[17]，KRAS基因突變與結直腸癌pTNM分期密切相關。由此可見，KRAS基因突變與結直腸癌密切相關，而KRAS基因突變與很多因素都有直接或間接的關系[18]。

本研究中，通過篩查結直腸癌患者，檢測出26例KRAS基因突變，提示KRAS在結直腸癌發(fā)生和進展中的重要性。通過選取的臨床病例統(tǒng)計發(fā)現，腫瘤高、中、低分化程度及pTNM分期與KRAS突變情況有顯著統(tǒng)計學差異，也有一些報告與本研究結果類似[9]。然而通過比對發(fā)現，KRAS突變組腺癌比例顯著高于未突變組，且具有統(tǒng)計學差異。相較于黏液腺癌，腺癌發(fā)生KARS基因突變的比例更高，說明KARS基因突變的患者更容易出現腺癌而非黏液腺癌。既往有研究證明，在許多結直腸腺瘤組織中也可以檢測到KRAS基因突變，這說明KRAS基因突變先于腫瘤發(fā)生之前，這也解釋了本研究結果的科學性。此外，本研究結果提示，腫瘤發(fā)生前的KRAS基因突變檢測，能為癌前患者作出風險評估，起到提前預防的效用。

綜上所述，KRAS基因突變與結直腸癌組織學類型和分化程度有一定相關性。本研究后續(xù)通過隨訪結直腸癌患者，對KRAS基因可能突變位點與突變率進行分析，這將有助于開展臨床個體化精準治療，提升患者的預后及生活質量[19]。