小四五顆粒調節狼瘡腎炎小鼠的免疫功能及機制①

曹 慧②，王福東③，孫樂棟2，劉 佳，李宗香

(1.桂林醫學院第二附屬醫院皮膚科， 廣西 桂林 541199；2.南方醫科大學第五附屬醫院皮膚科， 廣東 廣州 510515)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE)是一種累及多系統、多器官組織的全身性自身免疫性疾病，臨床高發于育齡期女性，本病臨床表現復雜多樣，病情反復難愈，病程遷延，嚴重危害我國人民健康。其中，狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE最嚴重的并發癥，并發率高達55%以上，且腎臟受累損害的程度與患者預后密切相關[1]。系統性紅斑狼瘡是由B細胞介導的慢性自身免疫性疾病，自身抗體的產生以及III型超敏反應的慢性系統性炎癥是該疾病的顯著特征[2]。自身抗體和相應抗原形成免疫復合物，沉積于各組織、器官，引起局部組織炎癥和損害[3]。LN是SLE所產生的免疫復合物沉積在腎臟，改變腎血管的通透性所引起的一種繼發性腎小球疾病。目前，國內外常規的藥物治療根據臨床表現的輕重，病理類型的不同，治療方案不一而足。主要的藥物有糖皮質激素、環磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等，但是長期應用大劑量免疫抑制劑，毒性反應大，長期應用糖皮質激素會增加SLE患者慢性器官損害并導致患者生存率下降。中醫認為，LN的發生屬正虛邪實，腎虛為本，熱毒為標[4]，治療應當以益腎健脾為根基[5-6]。小四五顆粒由東漢張仲景《傷寒論》中的小柴胡湯、五苓散及宋代《太平惠民和濟局方》中的四物湯三方組成，本文將探討該藥方對狼瘡腎炎的治療作用及其免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡雌性MRL/MpJ-Faslpr小鼠和8周齡SPF級雌性Balb/c小鼠，購自廣州市賽柏諾生物科技有限公司。小四五顆粒劑(柴胡、黃芩、半夏、人參、白術、茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、熟地黃、白芍、當歸、川穹等)由廣東一方制藥廠生產，每袋3 g，相當于生藥6 g。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 MRL/MpJ-Faslpr自發性狼瘡小鼠20只，隨機分成兩組，狼瘡對照組和小四五治療組，各10只，Balb/c小鼠10只為正常對照組，小四五治療組予小四五顆粒劑，制成每毫升含生藥6 g的水煎劑，根據許淑云主編的《藥理學實驗方法》，按公式：小鼠劑量(g/kg)=人用劑量×0.0026×50 g計算，小四五給藥組給予0.2 ml/20 g的小四五懸液灌胃，2次/d，連續6周，狼瘡對照組及正常對照組等體積生理鹽水灌胃，2次/d，連續6周。

1.2.2 尿蛋白含量檢測 于用藥后6周末采集小鼠晨尿，將所有尿液標本稀釋500倍，采用碧云天公司生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測尿蛋白含量，加入樣品及工作液后，37 ℃孵育30 min，酶標儀測定570 nm吸光度值，根據標準品計算樣品尿蛋白濃度。

1.2.3 血清IL-4、IL-10、IFN-γ檢測 小鼠于第6周末眼眶取血，4℃，4 000 r/min，離心15 min，取上清液凍存于-80 ℃備用，小鼠血清中IL-4、IL-10、IFN-γ檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 流式細胞儀檢測Th1與Th2細胞數量 小鼠處死后，分離脾臟100 mg，制備脾臟單細胞懸液，以每孔1×106個細胞接種于24孔細胞培養板中，加入細胞刺激劑及高爾基體抑制劑，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養5 h，固定、破膜、染色后，行流式細胞術，檢測脾臟中Th1與 Th2細胞數量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 尿蛋白測定情況

與正常組小鼠相比，狼瘡組小鼠尿蛋白含量顯著增加；與狼瘡組相比，小四五治療組小鼠尿蛋白含量降低(P<0.05)，見表1。

表1 不同組小鼠尿蛋白檢測情況

2.2 血清IL-4、IL-10、IFN-γ含量測定

與對照組小鼠相比，狼瘡組小鼠血清中IL-4、IL-10含量顯著增加，IFN-γ含量顯著降低；與狼瘡組相比，治療組IL-4、IL-10含量降低，增加IFN-γ含量(P<0.05)，見表2。

表2 小四五顆粒對MRL/MpJ-Faslpr小鼠血清IL-4、IL-10、IFN-γ的影響

2.3 Th1細胞與Th2細胞水平測定

流式細胞術檢測結果表明，與對照小鼠相比，狼瘡組小鼠脾臟中的Th1水平顯著降低，Th2細胞水平顯著升高(P<0.05)，與狼瘡組相比，小四五顆粒能顯著增加Th1細胞水平，降低Th2細胞水平，Th1細胞/Th2細胞比值顯著升高，見表3。

表3 小四五顆粒對MRL/MpJ-Faslpr小鼠脾臟Th1細胞和Th2細胞數量的影響

3 討論

系統性紅斑狼瘡的發生和進展與遺傳、免疫、感染、激素和環境因素等有關，患者B淋巴細胞異常增生，T淋巴細胞降低，體內出現大量抗體和致病性循環免疫復合物，激活補體系統，進而引起全身炎癥反應和免疫損傷[7]。近年來，機體免疫調節功能系統，尤其是Th1/Th2細胞失衡成為臨床研究SLE的熱點。 Th1細胞能分泌生成IFN-γ等因子，對細胞免疫具有介導作用，能促進T細胞分化及成熟、增殖，促使炎癥介質合成[8]。Th2細胞能分泌生成IL-4、IL-10等因子，對體液免疫具有介導作用，能促進B細胞分化及成熟、增殖，促使IgE、IgG類等抗體生成[9]。Th1細胞、Th2細胞及其分泌的細胞因子的平衡破壞在SLE發病機制中有重要作用。

狼瘡腎根據其臨床表現， 可歸屬于祖國醫學“水腫”“虛勞”“腎痹”等范疇。中醫學認為，LN的發生是由人體先天稟賦不足，陰陽氣血失調，加之毒邪侵入，導致毒邪內蘊于腎，血脈凝滯而致[10]。故本病以肝腎虧虛為本，熱毒瘀結為標，本虛標實的癥狀貫穿疾病的始終。小四五顆粒中，小柴胡湯疏通三焦、理氣和解；五苓散通陽化氣，利水滲濕；四物湯養血活血祛瘀。全方脾腎雙補，攻補兼施，陰陽相濟，可行氣祛瘀，升清降濁，水濕歸于正化，使尿蛋白減少，腎功能改善。四物湯為中醫補血理氣的經典方劑，現代研究發現，它于免疫系統的功能具有多向調節作用，能增強細胞免疫功能[11-12]。

研究結果顯示，MRL/MpJ-Faslpr小鼠脾臟Th1細胞/Th2細胞比值降低，與此相一致的是MRL/MpJ-Faslpr小鼠外周血中IFN-γ水平降低，IL-4、IL-10水平升高，經小四五顆粒處理后，可緩解Th1細胞/Th2細胞比例及其分泌的細胞因子不平衡。筆者推測小四五顆粒對狼瘡小鼠腎炎病情的改善，可能通過降低Th1細胞/Th2細胞比值，減少自身反應性B細胞及自身抗體的產生進而減少腎臟免疫復合物的沉積，最終減輕腎臟的損害。后續，筆者將深入開展相關機制研究。