哈密瓜酵素制備工藝探索優化及性能*

魏玉娟，郁梅山，李雪梅，張 苗，王晶晶

(河西學院，甘肅 張掖 734000)

隨著生活節奏加快，環境污染，社會競爭壓力增大以及年齡的增加，都會引起人體內產生的酶減少，甚至酶的活性降低。酶數量和活性的降低都會導致各種疾病的發生[1]。微生物酵素食品是以乳酸菌、酵母菌等多菌種復合發酵瓜果、蔬菜，形成富含脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶及乳酸、醋酸、少量乙醇、礦物質、維生素等次生代謝產物的液態或固態食品[2-3]。所含多種活性酶具有改善體內微生態環境、潤腸通便、美容養顏和降血糖等功效[4]。 微生物酵素產品主要盛行于日本、美國、一些歐洲國家及東南亞地區，且形成了品牌產業規模，而近十多年來，在中國也開始盛行起來，越來越多的酵素理念被引入到農業、食品、美容保健等領域[5-6]。

哈密瓜，古稱“甜瓜”，在我國的新疆、甘肅省的瓜州、敦煌等地都有大量的種植，而一些有疤痕、裂口、個頭不達標的哈密瓜無法銷售，以廢棄物的形式堆棄在田間地頭，不僅是資源的浪費，還造成環境污染。

以哈密瓜直接生產酵素產品鮮有報道。本實驗以哈密瓜為原料，加入不同菌種進行發酵，并通過實驗探索不同菌種、接種量、發酵溫度、發酵時間下的 pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羥自由基清除率、還原力來確定哈蜜瓜發酵制備酵素的最佳工藝條件。

1 實驗部分

1.1 實驗藥品、原料及儀器設備

實驗藥品及原料：三羥甲基氨基甲烷(分析純)、鐵氰化鉀(分析純)，天津市光復精化研究所；乙二胺四乙酸(分析純)、鄰苯三酚(分析純)，上海市醫藥工業公司；三氯化鐵(分析純)、鄰二氮菲(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)、硫酸亞鐵銨(分析純)、過氧化氫(分析純)天津市福晨化學試劑廠；酵母菌(食品級)安琪酵母股份有限公司；乳酸菌(食品級)北京川秀科技有限公司；哈密瓜，張掖農副市場。

實驗儀器設備：TDL-5臺式離心機，常州翔天實驗儀器廠；SHZ-D(III)循環水式真空泵，pHS-25pH計,鞏義市予華儀器有限責任公司；400 W高壓汞燈,自制。

1.2 實驗工藝

1.2.1 哈密瓜預處理

先使用高壓汞燈對工具、臺面進行紫外線消毒，將挑選好的哈密瓜用蒸餾水清洗干凈，在無菌臺上去核去皮，切成小塊，備用。

1.2.2 發酵工藝的優化

將新鮮切碎的哈密瓜分成5等份裝入玻璃錐形瓶中，并分別加入10%(哈蜜瓜質量)的蔗糖。分別接種不同量的菌種，在保證發酵液充分溶氧的條件下，于30 ℃(或37 ℃)，發酵 48 h。在此期間，每隔3 h測每組實驗的pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羥自由基清除率、還原力以確定哈蜜瓜發酵制備酵素的最佳工藝條件。

1.2.3 酵素性能的測定方法

1.2.3.1 pH值得的測定

用pH計測發酵液的pH值，測量前將pH計用標準液調至標準。

1.2.3.2 還原力的測定(鐵氰化鉀還原法)

取不同階段樣品2.5 mL于試管中，先后加入2.5 mL 濃度為0.2 mol/L 的磷酸緩沖液(pH=6.6)和2.5 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液充分混勻，置于50 ℃水浴反應20 min，結束后迅速冰浴冷卻并加入2.5 mL質量分數為10%的三氯乙酸混勻，在3000 r/min 條件下離心10 min，吸取上清液5 mL置于另一試管內依次加入 4 mL 蒸餾水和1 mL濃度為1%的三氯化鐵溶液，充分混勻后反應10 min，于700 nm波長處測定反應液吸光度，吸光度越大表明還原力越強，(蒸餾水做空白)。同時以相同濃度的Vc為陽性對照。

1.2.3.3 羥自由基清除力的測定(鄰二氮菲法)[7]

按表1加樣后，混合均勻，用超級恒溫水浴控制溫度在 37 ℃保溫 1 h，于 536 nm 處測定吸光值A樣品。同一測定重復3次。

表1 羥自由基清除力測定的加樣量Table 1 Sampling amount for determination of hydroxyl radical scavenging power

羥自由基清除率=(A樣品- A損)/(A空白- A損)×100%

式中，A樣品：緩沖液+ FeSO4+鄰二氮菲+樣品+ H2O2；A空白：緩沖液+ FeSO4+鄰二氮菲；A損傷：緩沖液+ FeSO4+鄰二氮菲+ H2O2。

1.2.3.4 鄰苯三酚自氧化法測定超氧化歧化酶(SOD)活性[8-9]

用超級恒溫水浴控制溫度在25 ℃，按表2的加樣量，以Tris-HCl緩沖溶液為空白對照，在325 nm波長下每隔30 s測一次A0、AS共測6次。

表2 SOD活性測定加樣量Table 2 Determination of SOD activity by adding samples

在此條件下，每鐘抑制鄰苯三酚自氧化率50%的酶量定為1個活力單位。

抑制率=(A0-AS)/AS×100%

SOD單位活力(U/mL)=[(A0-AS)/AS]/50%×反應總體積×(樣品稀釋倍數/樣液體積)

式中：A0：自氧化速率；AS：加入樣液后氧化速率。

2 結果與討論

2.1 酵母菌接種量的確定

接種不同量酵母菌(配比如表3所示)于30 ℃[10]，發酵 48 h，發酵液pH變化。

表3 酵母菌接種量表Table 3 Yeast inoculation scale

由圖1可以看出隨著酵母菌接種量的增大，發酵液的pH值下降越快，下降到最低pH值時也不容易回升。接種量在0.02%和0.05%時在24 h時降到最低，隨后一直處于緩慢的上升狀態中，而接種量為0.1%、0.15%和0.2%時pH下降很快，幾乎在9～15 h時發酵完成，發酵過程中有氣泡產生，發酵不穩定，風味不佳。因此，酵母菌發酵的最佳接種量為0.02%。

圖1 接種不同量酵母菌下發酵液的pH變化Fig.1 pH changes of fermentation broth inoculated with different amounts of yeast

2.2 乳酸菌接種量的確定

接種不同量乳酸菌(配比如表4所示)于37 ℃，發酵48 h，發酵液pH變化。

表4 乳酸菌接種量Table 4 Inoculation amount of lactic acid bacteria

由圖2看出pH一直處于下降階段，接種量在0.2%和0.5%時在21～24 h時降到最低，隨后處于緩慢的上升狀態中，而接種量為1%、1.5%和2%時pH下降過快，幾乎在6～12 h時發酵完成，發酵過程中有起泡產生，酸味強烈。因此，乳酸菌發酵的最佳接種量為0.02%。

圖2 接種不同量乳酸菌下發酵液的pH變化Fig.2 pH changes of fermentation broth inoculated with different amounts of lactic acid bacteria

2.3 發酵時間的確定

分別在三種條件下(配比如表5所示)，發酵48 h，發酵液pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羥自由基清除率、還原力的變化。

表5 不同菌種下的原料配比Table 5 Raw material ratio under different strains

2.3.1 發酵液pH變化

由圖3可知哈密瓜酵素的 pH 在前24～27 h一直處于下降過程，之后一直處于緩慢的上升過程，發酵前 27 h 是由于酵母菌在無氧條件下產生乙醇和二氧化碳，發酵液中由于二氧化碳濃度上升，碳酸濃度也隨之上升，而乳酸菌利用糖產生乳酸，因此pH值都下降。27 h后pH值處于緩慢上升，是由于微生物對發酵液中蛋白質水解和氨基酸的利用，產生乙酸及其它有機酸的共同作用結果[11]。酵母菌在27 h時的pH為3.72，酵母菌在27 h時pH為3.92，而雙菌在24 h時pH最低為4.7，風味最佳。

圖3 發酵過程中pH的變化Fig.3 Changes in pH during fermentation

2.3.2 發酵液SOD活性的變化

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，SOD 活性一直處于上升階段，酵母菌或乳酸菌單菌在27 h時達到最大值后都趨于平緩，雙菌是30 h時達到最大值后開始下降，但三種工藝的SOD的變化差別不是很明顯。

圖4 發酵過程中SOD的變化Fig.4 Changes of SOD during fermentation

2.3.3 發酵液羥自由基清除率的變化

羥自由基屬活性氧中的一種，可降解多糖、DNA和細胞膜等，是體內的強氧化，具有強氧化能力，在體內可與金屬離子發生氧化，使金屬離子形成高氧化態，促進人體衰老過程。羥自由基清除率利用顯色反應，在536 nm處有最大吸收。

由圖5可看出，隨著發酵時間的增長，三種工藝的發酵液的羥自由基清除率呈現不斷上升的趨勢，在27～30 h 時羥自由基清除率達到最大，之后緩慢下降并趨于平緩，雙菌發酵液的羥自由基清除率明顯高于乳酸菌和酵母菌。分析原因可能是由于雙菌中乳酸菌和酵母菌相互作用：乳酸菌將糖原分解成半乳糖和葡萄糖這些易于吸收的單糖，為酵母菌提供碳源[12]。并且有研究發現酵母菌和乳酸菌自身具有抗氧化能力，酵母菌的細胞壁多糖能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基等活性氧[13]。故根據發酵過程中自由基清除率的變化，雙菌發酵工藝較優。

圖5 羥自由基清除率的變化Fig.5 Changes of hydroxyl radical scavenging rate

2.3.4 發酵液還原力的變化

一種物質的還原能力的大小反映其抗氧化活性的大小。

由圖6看出，還原力一直處于上升階段，說明隨著發酵的進行發酵液中抗氧化成分增加，時也可以從圖6看出酵母菌、乳酸菌和雙菌的發酵最佳時間為 27～30 h。三種發酵工藝的發酵液還原力變化趨勢差別不明顯。

圖6 發酵過程中還原力的變化Fig.6 Changes in reducing power during fermentation

3 結 論

通過綜合分析各種情況下哈密瓜發酵工藝中的 pH 、還原力、羥自由基清除率、超氧化歧化酶(SOD)活性得出的結論是雙菌發酵的效果比單菌酵母菌或乳酸菌的更好，探索優化的最佳哈密瓜發酵制備酵素的工藝參數為：在切碎哈密瓜中加入10%(哈密瓜量，下同)的蔗糖，20%的去離子水，0.02%的酵母菌接種量，0.2%乳酸菌接種量，在 30 ℃下，發酵 27 h，得到的哈密瓜酵素原液還原力最高，pH為4.5～5，羥自由基清除率>85%，超氧化歧化酶(SOD)單位活力>110 U/mL(110000 U/L)。本實驗探索優化的哈密瓜發酵制備酵素工藝為工業加工生產哈密瓜酵素產品提供一定的參考。