基于16S rDNA高通量測序研究針灸對克羅恩病大鼠腸道菌群的調節作用

鐘蕊 林亞瑩 朱毅 吳煥淦 孫可鑫 黃艷 祁琴 吳璐一

摘要 目的：采用16S rDNA高通量測序技術分析針灸對克羅恩病（CD）大鼠腸道菌群物種相對豐度和多樣性的影響，探討針灸對克羅恩病的作用機制。方法：將40只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、隔藥餅灸組、電針組和西藥組，每組8只。采用2，4，6-三硝基苯磺酸溶液灌腸4周構建CD大鼠模型，隔藥餅灸組和電針組選取天樞（雙側）、氣海穴進行干預，西藥組采用柳氮磺吡啶溶液灌胃干預。干預結束后取結腸組織進行HE染色，收取大鼠糞便進行16S rDNA高通量測序并對進行物種相對豐度、alpha多樣性和基因功能代謝預測分析等。結果：隔藥餅灸組和電針組大鼠結腸組織病理學評分顯著低于模型組（P<0.01）。與正常組比較，模型組擬桿菌門、放線菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目、紫單胞菌科、普雷沃菌科、擬桿菌科、普雷沃菌屬等的相對豐度升高，厚壁菌門、變形菌門、梭菌綱、梭菌目、毛螺菌科、瘤胃菌科、乳酸桿菌屬等的相對豐度降低;在經過隔藥餅灸和電針治療后，上述大多數微生物相對豐度均有不同程度改善。與正常組比較，模型組腸道菌群的Chao1、Observed species、Shannon、Simpson等alpha多樣性指數均顯著下降（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組和電針組上述指數均顯著升高（P<0.05）。功能預測分析發現隔藥餅灸和電針均能調節參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝等的功能基因。結論：CD與腸道菌群結構變化有關，針灸能夠調節CD大鼠腸道菌群物種相對豐度和菌群多樣性。

關鍵詞 克羅恩病;針灸;腸道菌群;高通量測序;功能預測

Regulatory Effect of Acupuncture and Moxibustion on Gut Microbiota of Rats with Crohn′s Disease Based on 16S rDNA High-throughput Sequencing

ZHONG Rui1，LIN Yaying2，ZHU Yi2，WU Huangan2，3，SUN Kexin3，HUANG Yan2，QI Qin2，WU Luyi2，3

（1 Shanghai Qigong Research Institute，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200030，China; 2 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 3 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China）

Abstract Objective：To analyze the effects of acupuncture and moxibustion on the relative abundance and diversity of gut microbiota in rats with Crohn′s disease （CD） by 16S rDNA high-throughput sequencing and explore the mechanism of acupuncture and moxibustion on CD.Methods：Forty SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，an indirect moxibustion group，an electroacupuncture （EA） group，and a western medicine group，with eight rats in each group.The CD model was induced in rats by enema with 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid for four weeks.The bilateral “Tianshu” （ST 25） and “Qihai” （CV 6） were selected for intervention in the indirect moxibustion group and the EA group，and the rats in the western medicine group received sulfasalazine solution by gavage.After the intervention，the colon tissues and rat feces were collected for HE staining and 16S rDNA high-throughput sequencing，respectively.The sequencing results were analyzed for species relative abundance，alpha diversity，and functional gene prediction.Results：The histopathological scores of colon tissues of rats in the indirect moxibustion group and the EA group were significantly lower than those in the model group （P<0.01）.Compared with the normal group，the model group showed the increased relative abundance of Bacteroidetes，Actinobacteria，Bacteroidia，Bacteroidales，Porphyromonadaceae，Prevotellaceae，Bacteroidaceae，and Prevotella，and the decreased relative abundance of Firmicutes，Proteobacteria，Clostrida，Clostridiales，Lachnospiraceae，Ruminococcaceae，and Lactobacillus.After indirect moxibustion and EA treatment，the relative abundance of the majority of the above-mentioned microorganisms improved to varying degrees.Compared with the normal group，the model group displayed decreased alpha diversity indexes of the gut microbiota，such as Chao1，Observed species，Shannon，and Simpson （P<0.05）.Those indexes were elevated in the indirect moxibustion group and the EA group（P<0.05）as compared with those in the model group.As revealed by functional prediction analysis，both indirect moxibustion and EA could regulate functional genes involved in carbohydrate metabolism and amino acid metabolism.Conclusion：CD is related to changes in the structure of gut microbiota，and acupuncture and moxibustion can regulate the relative abundance and diversity of gut microbiota in CD rats.

Keywords Crohn′s disease; Acupuncture and moxibustion; Gut microbiota; High-throughput sequencing; Functional prediction

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.004

克羅恩?。–rohn′s Disease，CD）是一種反復發作的慢性腸道炎癥疾病，可累及胃腸道的各個部位。本病在臨床上常表現為腹痛、腹瀉，病程多遷延，不易根治。其發病機制尚未明確，目前多認為與遺傳、感染、腸道微生態失衡以及免疫紊亂等相關[1]。近年來大量研究指出，腸道菌群失調與CD發生發展關系密切。CD患者腸道菌群與正常人存在明顯差異，常表現為CD患者體內有益菌數量減少，病原菌和致病菌數量增加以及腸道菌群多樣性顯著降低等[2]。本病常規治療藥物主要包括氨基水楊酸類、糖皮質激素和免疫抑制劑等，但療效并不理想，且存在一定的不良反應。因此，尋找一種安全有效的治療手段至關重要。

針灸具有安全、復發率低以及遠期療效好等特點，作為一種補充替代療法廣泛地被臨床所應用[3-5]?，F代許多臨床研究表明針灸在改善CD患者臨床癥狀、控制病情活動、維持緩解方面具有較好的療效[6-8]。課題組前期研究表明針灸對CD患者具有良好的治療效果，能夠緩解CD患者的臨床癥狀和體征，有效減輕CD患者結腸炎癥反應，并能影響CD結腸黏膜組織異常的基因表達譜[9]。然而針灸對CD大鼠腸道菌群的調節作用尚不清楚，故本研究擬在前期研究的基礎上從腸道菌群角度探討針灸治療CD的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用體質量為（140±20）g的雄性清潔級SD（Sprague-Dawley）大鼠，于上海中醫藥大學實驗動物中心飼養。飼養條件：室溫為（20±2）℃，濕度50%～70%，12 h晝夜節律交替，自由飲水。適應性飼養5 d后，將一般情況正常的大鼠納入實驗。所有動物的使用嚴格按照國家實驗動物健康規定執行。實驗過程嚴格遵循動物倫理學標準，動物福利倫理委員會批準通過（倫理審批號：PZSHUTCM210305005）。

1.1.2 藥物 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS）（Sigma，美國，貨號：P2297）;柳氮磺吡啶腸溶片（上海中西三維藥業有限公司，國藥準字H31020450）。

1.1.3 試劑與儀器 無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10009228）;電針儀（南京濟生醫療科技有限公司，型號：HANS-200A）;戊巴比妥鈉（Sigma，美國，貨號：P3761）;全自動組織脫水機（Leica，德國，型號：APS300S）;石蠟包埋機（Leica，德國，型號：EG1160）;石蠟切片機（Leica，德國，型號：RM2235）;光學顯微鏡（Olympus，日本，型號：BX53）;糞便DNA提取試劑盒（TIANGEN，德國，貨號：DP328）;瓊脂糖（Oxoid，英國，貨號：LP0028A）;紫外微量分光光度計（Thermo Electron Corporation，美國，型號：840-210600）;PCR試劑盒（Kapa biosystems，美國，貨號：KK4601）;Hiseq測序儀（Illumina，美國，型號：2500）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照隨機數字表法將大鼠分為正常組、模型組、隔藥餅灸組、電針組和西藥組，每組8只。采用TNBS灌腸液制備大鼠CD模型[10]。大鼠稱重后，采用2%戊巴比妥鈉（20 mg/kg）腹腔注射麻醉。TNBS灌腸液制備：將無水乙醇加雙蒸水，配成50%的乙醇，然后將5%的TNBS與50%的乙醇按2∶1比例混合成TNBS灌腸液。以0.2 mL/100 g TNBS灌腸液進行灌腸;用12 cm長的灌腸針插入直腸約6～8 cm，1 mL注射器注入。每日觀察大鼠的精神狀態、進食、活動、大便性狀等一般情況。每隔7 d重復灌腸1次，共4次。

1.2.2 干預方法 造模結束后第2天進行干預。正常組不做任何處理，模型組造模后也不做任何處理，隔藥灸組和電針組造模后分別采用隔藥餅灸和電針大鼠天樞（雙側）、氣海穴。隔藥餅灸組中藥餅主要以附子、肉桂、丹參等藥研末，用黃酒調和之后使用模具制成餅，厚約0.5 cm，直徑1 cm，將大小約90 mg的艾炷放在藥餅上置于上述穴位上施灸，每次每穴各灸2壯。電針組采用疏密波，頻率2～100 Hz，電流2 mA，留針20 min。西藥組采用柳氮磺吡啶溶液灌胃。劑量為：按成人（70 kg體質量）∶大鼠（200 g體質量）=1∶0.018比例根據《藥理學實驗方法》制備灌胃溶液。上述3個觀察組大鼠均固定時間干預1次/d，共7 d。標本采集與處理治療結束之后，采用2%戊巴比妥鈉，40～50 mg/kg，腹腔注射麻醉，自肛門向上約2 cm處截取長6～8 cm的結腸，縱向剖開結腸，取出糞便放入凍存管中，于-80 ℃冰箱中保存，并將取得的結腸放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法觀察結腸組織病理學改變 主要步驟：結腸組織脫水、石蠟包埋、石蠟切片（厚度為4 μm），二甲苯、梯度乙醇、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇、伊紅染色、梯度乙醇、二甲苯、中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察組織形態并進行結腸組織學評分。

1.2.3.2 大鼠腸道菌群16S rDNA高通量測序 采用16S rDNA高通量測序進行大鼠糞便樣本中腸道菌群的檢測（n=7）。該測序方法通過對16S rRNA基因上的可變區域進行擴增，利用可變區域的差異來對不同菌屬的細菌進行分類鑒定，檢測方法如下：1）樣品DNA抽提：采用DNA試劑盒對大鼠糞便中的總DNA進行抽提，并采用紫外微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的濃度和質量，質控合格的DNA進入文庫構建。2）文庫構建：選擇V3-V4區進行擴增，并加上測序儀所需的接頭、測序引物和index序列，構建文庫。3）Illumina上機測序：文庫構建好后，使用Illumina HiSeq2500 PE250測序平臺進行上機測序，通過橋式PCR擴增生成DNA簇，檢測與DNA片段結合的dNTP熒光信號獲知DNA片段序列。4）生物信息分析：測序完成后，對原始數據進行質控，去除含N堿基、嵌合體的質量低等序列，用優化之后的序列進行運算分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類，每個OTU被認為可代表一個物種。用OTU代表序列與16S數據庫進行比對和物種注釋，得到OTU豐度表，最后基于OTU豐度表進行后續的可視化和統計化分析。采用R語言進行數據統計分析。

1.3 統計學方法 采用R語言3.2.3（http：//cran.r-project.org）中的Kruskal-Wallis檢驗進行組間差異物種豐度分析。采用SPSS 21.0統計軟件（IBM Co.，Armonk，NY，USA）對腸道組織病理學評分進行統計分析，服從正態分布的資料采用均數±標準差（±s）表示，而不服從正態分布的資料則采用M（P25，P75）來表示。方差齊性，組間比較采用方差分析（One-wayANOVA）中的最小顯著性差異（LSD），方差不齊性，采用非參數檢驗中的秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠結腸組織病理學觀察

光鏡下顯示正常組結腸黏膜結構完好，腸黏膜上皮連續覆蓋，黏膜固有層腺體排列整齊，走向規則，黏膜下層為疏松結締組織，無出血點、糜爛及潰瘍;模型組結腸黏膜、黏膜下層形態結構紊亂，結腸黏膜出血，可見裂隙樣潰瘍，黏膜下層和肌層有大量炎癥細胞浸潤;隔藥餅灸組結腸組織損傷程度明顯減輕，黏膜層結構尚完整，可見新生的黏膜上皮修復，炎癥細胞浸潤和出血程度均較模型組減輕;電針組結腸黏膜、黏膜下層以及肌層結構基本正常，有新生的黏膜上皮修復和愈合性潰瘍;西藥組結腸組織可見新生的黏膜上皮修復、愈合性潰瘍，炎癥細胞浸潤程度明顯減少，無明顯出血點。見圖1。

組織病理學評分結果顯示，模型組結腸組織病理學評分顯著高于正常組，差異有統計學意義（P<0.01）;而隔藥餅灸組、電針組和西藥組結腸組織病理學評分均顯著低于模型組，差異均有統計學意義（均P<0.01）。見圖2。

2.2 物種注釋豐度分析

根據OTU豐度表及其代表的不同物種，分別在門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）不同分類等級對各組樣品做相應的物種相對豐度和比例的柱狀圖。在門水平包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）4種優勢菌門，在屬水平普雷沃菌屬（Prevotella）、氏菌屬（Roseburia）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬XIVa（Clostridium XIVa）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等7種菌屬是主要優勢細菌。與正常組比較，模型組擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌目（Bacteroidiales）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、普雷沃菌屬（Prevotella）等的相對豐度升高，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等的相對豐度降低;在經過隔藥餅灸、電針和西藥治療后，上述大多數微生物相對豐度均有不同程度改善，其中隔藥餅灸還能增加乳酸桿菌屬的相對豐度，電針還能增加瘤胃菌科的相對豐度。見圖3。

2.3 針灸對CD大鼠腸道菌群alpha多樣性的影響分析

alpha多樣性分析用來評估單個樣品中的物種多樣性，主要包括Observed species指數、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數以及PD whole tree指數，其中反映群落豐富度的指數主要有Chao1和Observed species。與正常組比較，模型組Chao1和Observed species指數均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組Chao1和Observed species指數均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），電針組Chao1和Observed species指數均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），西藥組Chao1和Observed species指數與模型組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

反映群落多樣性的指數主要有Shannon、Simpson和PD whole tree指數。與正常組比較，模型組Shannon、Simpson和PD whole tree指數均有一定程度的下降，Shannon、Simpson指數差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），但PD whole tree差異無統計學意義（P>0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組Shannon、Simpson和PD whole tree指數均有一定程度的升高，Shannon、Simpson指數差異有統計學意義（P<0.01），但PD whole tree指數差異無統計學意義（P>0.05），電針組Shannon、Simpson和PD whole tree指數均有一定程度的升高，Shannon、Simpson指數差異有統計學意義（P<0.01），但PD whole tree指數差異無統計學意義（P>0.05），西藥組Shannon、Simpson指數與模型組差異無統計學意義（P>0.05），PD whole tree指數差異有統計學意義（P<0.01）。見圖5。

2.4 針灸對CD大鼠腸道菌群16S功能預測代謝功能的影響

為了解CD大鼠腸道菌群代謝情況以及針灸對其調節作用，本研究采用PICRUSt（V1.0.0）軟件來預測5組腸道菌群潛在代謝功能的改變。5組間共有27個京都基因和基因組百科全書（KEGG）代謝通路差異有統計學意義（P<0.05），在豐度前20的KEGG通路中，與正常組比較，膜運輸、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、復制和修復、翻譯等20個KEGG代謝通路中的功能基因在模型組中的相對豐度均降低;與模型組比較，上述20個KEGG代謝通路中的功能基因在隔藥餅灸組、電針組和西藥組中的相對豐度均增加。見圖6。

3 討論

本研究采用16S rDNA高通量測序研究CD大鼠微生物群落組成和相對豐度，以及針灸對其調節作用，結果發現CD大鼠的腸道菌群alpha多樣性降低，這與以往研究結果一致[11-13]。而在經過隔藥餅灸和電針治療后，腸道菌群多樣性顯著升高，表明隔藥餅灸和電針能在一定程度上提高CD大鼠的腸道菌群群落豐富度和多樣性，改善腸道微生態。已有大量研究表明針灸能夠調節腸道菌群紊亂，改善腸道菌群多樣性，從而達到治療胃腸疾病的目的[14]。課題組前期研究發現，艾灸治療7 d可以增加結腸炎大鼠腸道菌群的多樣性，提高腸道中乳酸桿菌等益生菌的數量，使結腸炎大鼠失調的腸道菌群向正常的方向轉變[15]，可能是針灸治療結腸炎的關鍵環節，但其具體機制尚不明確。侯天舒等[16]研究發現，電針能夠改善潰瘍性結腸炎大鼠腸道菌群多樣性，升高乳酸桿菌和毛螺科菌的相對豐度，降低雙酶梭菌的相對豐度。張博等[17]采用針灸聯合湯藥療法治療潰瘍性結腸炎患者，發現其能夠提高腸道菌群內的乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的相對豐度，降低致病菌相對豐度。王園園[18]在對CD模型大鼠進行針刺與艾灸治療后發現，針灸可以調節CD大鼠腸道菌群的失衡狀態，改善大鼠腸道菌群的多樣性及益生菌與有害菌的豐富度。

本研究發現CD大鼠腸道的優勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門，這與相關文獻[18]報道相似。擬桿菌門包括擬桿菌綱、黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱，其中擬桿菌綱在有些時候能夠成為致病菌，在CD大鼠腸道中的相對豐度高于正常組。厚壁菌門包括梭菌綱、芽孢桿菌綱、柔膜菌綱，在大鼠腸道中占據主要優勢的梭菌綱大部分都是產丁酸鹽菌，瘤胃菌科也是一種產丁酸鹽菌，其產生的丁酸鹽具有抑制炎癥反應的作用[19]，模型組梭菌綱、瘤胃菌科的相對豐度低于正常組，可能與模型組腸道炎癥反應密切相關，而隔藥餅灸和電針對擬桿菌綱有明顯的下調作用，對梭菌綱有明顯的上調作用，提示針灸治療CD可能與調節上述細菌有關。普雷沃菌屬是一種常見的條件致病菌，研究表明普雷沃菌屬主要激活Toll樣受體2，通過抗原呈遞細胞產生IL-23、IL-1，普雷沃菌屬還能刺激上皮細胞產生IL-8、IL-6和CCL20，促進黏膜Th17免疫應答和中性粒細胞募集[20]。普雷沃菌屬介導的黏膜炎癥導致炎癥介質、細菌和細菌產物的全身傳播，進而可能影響全身疾病的結局[21]。這表明某些普氏菌菌株可能是臨床上重要的病原菌，可促進慢性炎癥影響人類疾病的發生發展。而在本研究中，隔藥餅灸和電針能夠顯著降低大鼠腸道中普雷沃菌屬的相對豐度，表明針灸可能通過降低該菌屬而對腸道黏膜起到一定修復作用。

為了解CD大鼠腸道菌群代謝情況以及針灸對其調節作用，本研究基于16S rDNA高通量測序的結果對5組大鼠腸道微生物潛在代謝功能進行預測。結果顯示在L2水平，與正常組比較，碳水化合物代謝、氨基酸代謝通路中的功能基因在模型組中的相對豐度均降低;與模型組比較，碳水化合物代謝、氨基酸代謝通路中的功能基因在隔藥餅灸組、電針組和西藥組中的相對豐度均增加。表明CD大鼠紊亂的腸道菌群將影響碳水化合物代謝、氨基酸代謝通路，而隔藥灸和電針均具有一定的調節作用。氨基酸是維持人體正常免疫能力，保護人體抵御疾病的必需物質，氨基酸及其代謝產物在促進腸道生長、維持腸道功能和腸黏膜完整性等方面發揮重要作用[22]。CD患者體內氨基酸代謝異常已被廣泛報道[23-25]，這與本研究結果類似。而隔藥灸和電針均能調節與氨基酸代謝相關的功能基因的豐度，從而保護腸道黏膜和腸道屏障。

綜上所述，CD大鼠在門、綱、目、科、屬等不同分類水平上均存在微生物組成和相對豐度的變化，而在經過隔藥餅灸和電針治療后，上述大多數微生物相對豐度均有不同程度改善。本研究除了發現隔藥餅灸和電針對CD大鼠腸道菌群調節作用的共性之外，還有個性之處，例如，隔藥餅灸還能增加CD大鼠乳酸桿菌屬等益生菌的相對豐度，而電針則能增加CD大鼠瘤胃菌科等產丁酸鹽菌的相對豐度?？偨Y起來，隔藥餅灸和電針均可以調節CD大鼠腸道菌群結構的紊亂。本研究的不足之處在于，16S rDNA高通量測序技術得到的序列大部分都注釋不到屬水平，今后可以應用宏基因組測序鑒定到種水平甚至菌株水平，從而更有利于闡明微生物群落在針灸治療CD中的作用機制。

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（2022-01-06收稿 本文編輯：吳珊）