油茶轉錄因子基因CoSOC1-like 的克隆和表達分析

黃國文，管天球，趙雨云，陳莫林，劉宏輝

(湖南科技學院化生院，湖南 永州 425199)

油茶（Camellia oleiferaAbel.）為山茶科山茶屬常綠灌木或小喬木，是一種重要的木本油料樹種[1]，主要分布在我國長江流域及以南地區(qū)的湖南、安徽、廣東、廣西、福建等省區(qū)。茶油含有90%以上不飽和脂肪酸，具有降血脂、預防心腦血管疾病等功效，是有利于人類健康的食用油。油茶是蟲媒、兩性花的異花授粉植物。油茶的成花時間長。“湘林1 號”油茶（Camellia oleifera‘Xianglin1）’的花芽分化從5 月下旬開始到9 月上旬結束，經過生理分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房和花藥形成期、雌雄蕊成熟期等階段[2]，然而，“長林4 號”油茶（Camellia oleifera‘Changlin4）’花芽分化的開始時間是6 月上旬[3]，10月中下旬開花結果。植物成花受光周期途經、自主春化途徑、赤霉素途徑和糖類途經等的基因調節(jié)，也受開花整合子SOC1、FT、LFY等基因的調節(jié)，最后受同源異形基因AP1、SEP、AG等的調控完成花器官發(fā)育[4-5]。SOC1基因是MADSbox 家族基因之一。MADS-box 基因家族在調節(jié)植物的花器官發(fā)育、開花時間、胚珠發(fā)育、根瘤形成和對環(huán)境信號反應等方面起作用[6-7]。在真核生物中，MADS-box 基因家族是一類編碼轉錄因子的基因組成，其蛋白質具有高度保守的MADS 結構域[8]，能夠使本身蛋白質以二聚體的形式結合其它輔助因子和DNA，調節(jié)基因的時空表達。在被子植物中，大多數SOC1基因含有 7 個外顯子和6 個內含子，其編碼的蛋白除了含有保守的MADS-box 以外,還含有K-box 和非保守的I 區(qū)、C 區(qū)，因此，屬于MIKC 型[9]。K-box 是一個半保守片段，主要由有3 個α 螺旋組成，其中，前面2 個螺旋和第3 個螺旋的作用分別是決定本身蛋白二聚化的特異性和形成高級復合物，是蛋白質相互作用部位[10]；I 區(qū)的序列變化較大，主要促進蛋白二聚體本身與DNA 的結合；C 區(qū)由疏水性氨基酸組成的最不保守區(qū)域，是基因轉錄的激活區(qū)，但有些SOC1 蛋白也具有一個保守的MOTIF結構域，因此，被劃入SOC1/TM3 亞家族[11]，SOC1的不同功能主要由不同的C 區(qū)基序完成[12]。目前，在大豆（Glycine max(Linn.) Merr.）[13-14]、玉米（Zea maysL.）[15]、煙草（Nicotiana tabacumL.）[16]、芒果（Mangifera indicaL.）[17]、油菜（Brassica campestrisL.）[18]、擬南芥(Arabidopsis thaliana（L.）Heynh)[19-20]、茶樹(Camellia sinensis(L.) O.Ktze)[21-22]、橘子(Citrus reticulataBlanco)[23]、火龍果 (Hylocereus polyrhizus(Haw) Britt &Ros)[24]、牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）[25]等植物中的SOC1基因序列和作用都有報道，但關于油茶中SOC1同源基因的序列和作用的報道很少。本研究采用RT-PCR 技術和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技術克隆油茶的CoSOC1-like基因，用生物信息學方法研究其序列特征，用熒光定量PCR 技術研究CoSOC1-like基因的表達模式，用基因瞬時表達法研究蛋白的亞細胞定位，為進一步研究油茶CoSOC1-like基因的功能打下基礎，為揭示油茶成花的分子機制和花期調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

油茶材料采摘于湖南科技學院油茶示范基地的3 年生油茶‘湘林210（’Camellia oleifera‘Xianglin 210）’品種。采摘后的葉片立即放于干冰盒中冷凍保存運輸，后轉存入-70 ℃超低溫冰箱，在48 h內提取RNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶CoSOC1-like基因的克隆 采用RACE方法克隆油茶CoSOC1-like基因[26]。以油茶幼嫩葉片為材料，用RNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取葉片總RNA。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA 的質量。以RNA 完整且無蛋白質污染的RNA 作為底物，按照反轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）合成cDNA 第一鏈。擴增CoSOC1-like基因的引物序列見表1。以cDNA第一鏈為模板，F1 和R1、F2 和R2 為引物和高保真的PFU 酶（北京全式金生物技術有限公司）構建反應體系，進行巢式PCR 擴增，獲得基因的核心片段。使用3′和5′RACE cDNA 擴增試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提供的引物、F3 和R3、F4 和R4 引物進行PCR 擴增，獲得基因的3′端序列片段和5′端序列片段。每個片段經過瓊脂糖凝膠回收試劑盒（上海生物工程股份有限公司）回收，與pGM-T 載體（北京索萊寶公司）連接并轉化大腸桿菌DH5α 細胞，并涂布在含有100 μg·mL-1氨芐青霉素的固體LB 培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選，37 ℃培養(yǎng)16 h。用PCR 法鑒定白色菌落的陽性克隆。用質粒提取試劑盒（上海生物工程股份有限公司）提取5～10 個陽性克隆的質粒，送至北京擎科生物科技有限公司湖南分公司測序。將每個序列在DNAMAN 軟件中拼接，獲得含有全長CoSOC1-like基因序列的片段。

表1 CoSOC1-like 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of CoSOC1-like

1.2.2 油茶CoSOC1-like基因序列的生物信息學分析 用DNAStar 5.0 軟件分析油茶CoSOC1-like基因開放閱讀框，并推導氨基酸序列。用DNAMAN 軟件預測油茶CoSOC1-like 蛋白質序列的疏水性、親水性和跨膜結構域。采用SOPMA在線工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/）分析蛋白質二級結構；用Phyre2 在線工具分析蛋白質三級結構；在PSORT 在線工具（http://psort.hgc.jp/）上進行亞細胞定位預測；運用在線KinasePhos 2.0 軟件對CoSOC1-like 蛋白作用方式預測；利用MEGA5.0軟件的Clustal W 法進行比對，用鄰接法構建同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(自展值Bootstrap 設定為1 000,其它參數的缺省值不變)。

1.2.3 油茶CoSOC1-like基因表達模式分析 在2020 年12 月20 日取處于開花后期油茶的根、幼莖、葉片、營養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊、柄托雌（花柄、花托和雌蕊部分的總稱，因為花柄短并且花托和子房緊密結合，不易區(qū)分且很難分離）等部分提取總RNA。在2021 年5 月30 日取處于花芽生理分化期油茶的根、幼莖、葉片、頂芽（未出現分化的芽）、營養(yǎng)芽、花芽和幼果等部分提取RNA。在2021 年6 月30 日取處于雌蕊和雄蕊形成期油茶的根、莖、葉片、營養(yǎng)芽（0.4 cm 左右）、花芽（0.8 cm 左右）、果皮和種子等部分提取RNA。在2021 年7 月30 日取處于花芽子房和花藥形成期（去掉苞片的花芽中有肉眼可見的約2 mm 左右分叉柱頭、1 mm 左右的雄蕊）油茶的根、莖、葉片、營養(yǎng)芽（0.5 cm 左右）、花芽（1.3 cm 左右）、果皮和種子等部分提取RNA。所有的RNA 用反轉錄試劑盒合成cDNA 后用于熒光定量PCR。測定基因表達量的引物為，油茶CoSOC1-like基因引物為F:5′TCTCTGCGATGCTGAGGTTG 3′，R:5′ TCTATCTGCTTTGCCATGTCTG 3′，片段長度195 bp。ACTIN基因引物為F:5′ TAGACTTGC GGCATCAGTTAGA 3′，R:5′ TTCACGGTTTTT GGACGGATT 3′，片段長度176 bp。所用儀器為BIO-RAD 的 CFX Connect Real-Time System，試劑是賽默飛世爾科技有限公司的Power SYBR?Green PCR 預混液（貨號:4367659) 。反應體積為 20 μL，反應程序為：95.0 ℃ 3 min，95.0 ℃15 s，55.0 ℃ 20 s，72.0 ℃ 30 s，35 個循環(huán)，72.0 ℃ 5 min，4 ℃保存。每個樣品設置 3 次重復，采用 2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量，利用 SPSS19 軟件的單變量方差分析的 Duncan 多重比較法進行顯著性差異和標準誤分析。

1.2.4 油茶CoSOC1-like 蛋白的亞細胞定位分析

以擴增油茶CoSOC1-like基因全長的加入XbaI酶切位點的正向引物（F:5′ GCTCTAGAG ATGGTG AGAGGGAAGACTCAGATGA 3′）、加入了XmaI 酶切位點的反向引物（R:5′ TCCCCCCGGGGTAACT TCTGAGGCGAAGCACGCT 3′）和高保真的PFU酶進行PCR 擴增出基因全長。對CoSOC1-like基因全長和pBI121-EGFP 質粒（湖南豐輝生物科技有限公司）分別進行XbaI 和XmaI（北京NEB公司）雙酶切，用瓊脂糖凝膠DNA 片段回收試劑盒對酶切片段進行回收，然后用T4 DNA 連接酶（美國clontech 公司）連接這2 個片段，轉化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，用含有抗生素Amp 的LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)，對菌斑進行PCR 鑒定和測序鑒定獲得陽性克隆。將此陽性克隆用熱激法轉化到農桿菌EHA105 菌株中。用含有0.1 mol·L-1乙酰丁香酮和25 μg·mL-1利福平的YEB 培養(yǎng)基培養(yǎng)農桿菌EHA105 到OD600為0.5～0.6 時，轉速5 000 rpm離心10 min 收集農桿菌，用重懸液（10 mmol·L-1MES，0.1 mmol·L-1乙酰丁香酮和10 mmol·L-1氯化鎂，過濾除菌）懸浮農桿菌，用注射器將農桿菌注射到洋蔥(Allium cepaL.)鱗片內表皮中，1 d后取洋蔥鱗片內表皮在熒光顯微鏡（日本Nikon ECLIPSE Ni-U）下觀察EGFP 蛋白的綠色熒光。

2 結果與分析

2.1 油茶CoSOC1-like 基因的克隆和序列分析

CoSOC1-like基因的核心片段用PCR 反應擴增，其產物經凝膠電泳檢測，表明擴增產物約在350 bp 左右處有一條亮帶，無其它雜帶（圖1）。用5′RACE 反應和3′RACE 反應，擴增基因的5′端序列和3′末端序列；經過測序和拼接，獲得序列1 025 bp 片段。經過開放閱讀框分析，此DNA 片段包含1 個完整的654 bp CDS 和150 bp 5′UTR、221 bp 3′UTR（圖2）。

圖1 油茶CoSOC1-like 基因片段的擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis result of CoSOC1-like fragment of Camellia oleifera from RT-PCR

2.2 油茶CoSOC1-like 蛋白質的氨基酸特征和一級結構分析

油茶CoSOC1-like基因的CDS 序列編碼217個氨基酸組成的蛋白質(圖2)。蛋白質分子量為24.958 kDa，等電點為6.8。帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu)數量為37 個，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)數量為36 個，平均疏水性值為-0.77，平均親水性值為0.361，屬于親水性蛋白。該蛋白無信號肽位點,是非分泌蛋白，也無跨膜螺旋區(qū)。

油茶CoSOC1-like 蛋白質與其它物種SOC1蛋白的同源性比對結果（圖3）表明：它與茶樹SOC1-like（XP-028068271.1）的同源性為97.7%、與榴蓮（XP_022769695.1）的SOC1-like 同源性為78.4%、與核桃（XP_018851690.1）的SOC1-like 同源性為75.46%、與加州白櫟（XP_030930174.1）的SOC1同源性為79.1%，與獼猴桃（AKH61958.1）SOC1e 同源性為82.16%、與山核桃（AHI85950.1）的SOC1 同源性為75.35%，與楊梅（KAB1200892.1）的SOC1同源性為75.94%，表明所克隆到的片段為油茶SOC1同源基因，本文將該基因命名為CoSOC1-like,并在GenBank 注冊，登錄號為MT036382。該序列蛋白質CoSOC1-like 結構包含MADS-box（1-74 位的氨基酸）、I-domain（75-83 位的氨基酸）、K-box（84-172 位的氨基酸）、C-domain四種結構域，屬于植物Ⅱ型MADS-box基因的蛋白結構，C-domain 中含有SOC1 MOTIF，因此CoSOC1-like 屬于SOC1/TM3 型。

圖2 CoSOC1-like 基因cDNA 全長序列和開放閱讀框及其氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of CoSOCl-like

圖3 CoSOC1-like 基因編碼的氨基酸與其它植物的SOC1 的序列比對Fig.3 Alignments of the CoSOC1 -like deduced amino acid sequences with other SOC1 proteins from plants

2.3 油茶CoSOC1-like 蛋白質的二級結構預測

蛋白質二級結構是指蛋白質多肽鏈中氨基酸主要依賴于氫鍵而建立的有規(guī)則重復的構象，主要包括α-螺旋、β-折疊片、β-轉角和無規(guī)則卷曲。油茶CoSOC1-like 蛋白的二級結構（圖4）表明：油茶CoSOC1-like 蛋白含有α-螺旋56.68%、β-轉角4.15%、折疊延伸鏈10.14%和無規(guī)卷曲29.0%。在蛋白質的84—172 位K-box 的氨基酸段有3 個很明顯的α-螺旋，這3 個α-螺旋是MIKC 型MADSbox 基因的特征序列。在蛋白質的C-domain 的氨基酸段主要是卷曲和折疊延伸鏈組成。

圖4 CoSOC1-like 蛋白的二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of CoSOC1-like protein

2.4 油茶CoSOC1-like 蛋白質的三級結構預測

蛋白質的三級結構是指一條多肽鏈在二級結構甚至結構域的基礎上，依靠氨基酸側鏈基團的疏水作用、范德華力及氫鍵和靜電作用，進一步盤旋和折疊形成特定空間結構。油茶CoSOC1-like 蛋白三級結構（圖5）表明：CoSOC1-like 屬于SRF-LIKE家族的蛋白質，預測的油茶CoSOC1-like 三級結構的肽鏈與二級結構的預測結果較一致。在CoSOC1-like 蛋白質的氨基端有2 個明顯的α-螺旋（紅色和黃色螺旋部分），屬于蛋白的MADS-box區(qū)域；中間部分有2 個同向平行的折疊延伸鏈，還有一個較長的α-螺旋（青綠色α-螺旋部分）屬于K-box 域；蛋白的羧基端是無規(guī)卷曲（深藍色部分）。整個蛋白質折疊成了一個緊密的并且有“空穴”（活性部位）的空間結構，這種結構與它結合DNA 和激活基因轉錄功能相適應。

圖5 CoSOC1-like 蛋白質三級結構預測Fig.5 Tertiary structure prediction of CoSOC1-like protein

2.5 油茶CoSOC1-like 蛋白的亞細胞定位和磷酸化位點分析

預測油茶CoSOC1-like 蛋白質的亞細胞定位表明：油茶CoSOC1-like 蛋白沒有信號肽存在，不是外分泌蛋白；在蛋白質153 位上存在亮氨酸拉鏈模式（LKEKEKVLTAENAKLCEKYGLL），3 位上存在SRF 型轉錄因子DNA 結合和二聚化結構域(RGKTQMRRIENATSRQVTFSKRRNGLLKKAFE LSVLCDAEVALIIFSPRGKLYEF)，CoSOC1-like位于細胞核的可能性最大，其次為線粒體中(表2)。

表2 CoSOC1-like 蛋白質亞細胞定位分析結果Table 2 Subcellular localization prediction of CoSOC1-like protein

將CoSOC1-like基因與載體pBI121-EGFP 融合，構建的pBI121-CoSOC1-like-EGFP 融合載體轉化洋蔥表皮細胞，以轉化空載體的洋蔥表皮細胞作為對照，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現，對照中整個洋蔥表皮細胞（包括細胞質和細胞核）都發(fā)出綠色熒光（圖6 a、c），說明該空載體是有作用的；融合載體轉化的洋蔥表皮細胞中只有細胞核中發(fā)出綠色熒光（圖6 d、f），說明CoSOC1-like 蛋白不是定位于線粒體，而是定位于細胞核中。

圖6 熒光顯微鏡（200X）下觀察CoSOC1-like 蛋白在洋蔥表皮細胞中的定位Fig.6 Localization of CoSOC1-like protein in oinion epidermal cells observed in a fluorescence microscope（200X）

對CoSOC1-like 蛋白序列修飾位點分析表明：CoSOC1-like 蛋白含有17 個絲氨酸磷酸化位點、10 個蘇氨酸磷酸化位點、4 個酪氨酸磷酸化位點，說明該蛋白活性受磷酸化作用。油茶CoSOC1-like 轉錄因子可能是通過蛋白質磷酸化激活，與有關基因的啟動子區(qū)相互作用達到調節(jié)靶基因表達的目的。

2.6 油茶CoSOC1-like 蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析

對油茶CoSOC1-like 蛋白與茶樹、地花（Monotropa hypopitysLinn.）、獼猴桃、小果咖啡（Coffea arabicaL.）、雞血藤（Spatholobus suberectusDunn）、大豆、加州白櫟、栓皮櫟（Quercus suberL.）、楊梅、山核桃、核桃、擬南芥、麻瘋樹(Jatropha curcasL.)、煙草、河岸葡 萄 (Vitis ripariaMchx.)、蓖 麻 (Ricinus communisL.)、小 麥(Triticum aestivumL.)、水稻 (Oryza sativa‘ Japonica Group’)、高 粱(Sorghum bicolorL.)、玉米等植物SOC1 及其同源蛋白，在氨基酸水平構建系統(tǒng)進化樹，結果(圖7)表明：以小麥、水稻、高粱、玉米等單子葉植物SOC1 及其同源蛋白作為外群，可以將比較的其他植物SOC1 及其同源蛋白分為2 個分化類群。第1 個類群中包含油茶CoSOC1-like、茶樹2 個SOC1-like、地花SOC1、獼猴桃的SOC1e和SOC1i、小果咖啡SOC1-like、雞血藤SOC1、大豆的SOC1、加州白櫟SOC1、栓皮櫟SOC1 isoform X1、楊梅SOC1、山核桃的SOC1、核桃SOC1-like、擬南芥SOC1、麻瘋樹SOC1 isoform X1，自展支持率為100%；油茶CoSOC1-like 與茶樹2 個CsSOC1-like 聚類在同一個進化支上，自展支持率為100%。第2 個類群包括茶樹SOC1-like isoform X1 和X2、煙草SOC1-like、河岸葡萄SOC1、蓖麻的SOC1，自展支持率為100%。說明油茶的CoSOC1-like 與茶樹SOC1-like 的親緣關系最近，與獼猴桃SOC1e 和SOC1i、地花SOC1 的親緣關系較近，與小果咖啡SOC1-like、雞血藤SOC1、大豆的SOC1、加州白櫟SOC1等的親緣關系較遠，與茶樹的SOC1-like isoform X1 和X2、煙草SOC1-like、河岸葡萄和蓖麻的SOC1 的親緣關系更遠。這說明油茶CoSOC1-like具有較高種屬特性，可為今后研究油茶CoSOC1-like基因的功能提供相應的參考。

圖7 油茶CoSOC1-like 與其他物種SOC1 同源蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.7 Phylogenetic evolutionary tree analysis of CoSOCl-like and homologous SOC1 proteins form other plants

2.7 油茶CoSOC1-like 基因的表達分析

為了理解油茶CoSOC1-like基因的表達情況，分析了不同生長發(fā)育時期的油茶各個器官的基因表達量。對處于開花后期油茶植株的根、莖、葉、營養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊、柄托雌（花柄、花托和雌蕊部分）等部位進行了熒光定量RT-PCR 分析，結果（圖8）表明：CoSOC1-like基因在所檢測的各個部位都有表達，其中，在根和莖中表達水平相對較高，在葉片、營養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊和柄托雌等部位表達水平相當。對處于花芽生理分化期油茶的各個器官的熒光定量RT-PCR 分析結果（圖9）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相對表達量最多，在根、莖、葉、頂芽、營養(yǎng)芽、幼果中都有一定的相對表達量且表達量相當。對處于雌蕊和雄蕊形成期油茶的各個器官的熒光定量RTPCR 分析結果（圖10 A）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相對表達量最多，在根、莖、葉、營養(yǎng)芽、果皮和種子中的相對表達量差別不大。對花芽處于子房和花藥形成期油茶的各個器官的熒光定量RT-PCR 分析結果（圖10 B）表明：CoSOC1-like基因在花芽中的相對表達量最多，在根、莖和葉中的相對表達量較多，在營養(yǎng)芽、果皮和種子中的相對表達量較少，并且在營養(yǎng)芽、果皮和種子中有一定的絕對表達量。這些結果說明，CoSOC1-like基因不僅可以調節(jié)生理分化期、雌蕊和雄蕊形成期、子房和花藥形成期的花芽生長分化，也可以調節(jié)根、莖、葉、營養(yǎng)芽、果皮和種子的生長發(fā)育。

圖8 油茶開花后期的CoSOC1-like 基因在不同部位的相對表達量Fig.8 Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the late flower stage

圖9 油茶花芽生理分化期的CoSOC1-like 基因在不同部位的相對表達量Fig.9 Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stage of physiological differentiation of flower bud

圖10 油茶花芽不同分化期的CoSOC1-like 基因在不同部位的相對表達量Fig.10 Relative expression level of CoSOC1-like gene of different parts of Camellia oleifera in the stages of different differentiation of flower bud

3 討論

植物從幼年期生長到成熟期以后，就進入成花階段。這個階段包括植物感受開花信號的刺激，誘導植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉化的成花誘導階段，花的分生組織分化成花原基和花器官原基的分化階段以及花器官形成和生長等3 個階段[27-28]。SOC1基因是開花整合子基因，能夠感受光周期途徑、自主/春化途徑、赤霉素途徑、糖類途徑和溫敏途徑等開花刺激途徑中的信號，誘導花分生組織特征的表達和花器官的形成，促進植物開花[29-31]。

本試驗根據在很多物種中存在的SOC1同源基因序列，利用RACE 方法，成功地從油茶中克隆出油茶SOC1同源基因cDNA 序列，命名為CoSOC1-like，基因編碼區(qū)654 bp 核苷酸，編碼217 個氨基酸,GenBank 登陸號為MT036382。同源蛋白質比對結果表明，油茶CoSOC1-like 蛋白具有MADS-box 家族基因的typeⅡ型結構，包含MADS-box、I-domain、K-box 和C-domain 4 部分,且在C 結構域含有SOC1MOTIF 結構，屬于SOC1/TM3 型亞家族基因，是一個MADS-box 家族轉錄因子[32]。蛋白序列分析表明，油茶的CoSOC1-like 蛋白沒有跨膜螺旋區(qū)，不含信號肽，含有SRF 型轉錄因子結合DNA 的結構域；基因瞬時表達表明CoSOC1-like 蛋白定位于細胞核，與綠竹SOC1-like[33]和小麥TaSOC1-like 蛋白[34]的定位是一致的，符合轉錄因子的結構特點和亞細胞定位特征。油茶CoSOC1-like 蛋白有31 個磷酸化位點，它的二級結構和三級結構的多肽鏈特征與它的一級結構是一致的，該蛋白的三級結構表現出的緊密又有活性部位的空間結構，說明CoSOC1-like 蛋白通過磷酸化作用結合DNA 并激活基因的轉錄作用。

系統(tǒng)進化樹分析表明，油茶CoSOCl-like 蛋白與茶樹SOC1-like 蛋白聚為一枝，親緣關系最近，其次與獼猴桃SOC1e 和SOC1i、地花的SOC1的親緣關系較近，與小果咖啡SOC1-like、雞血藤和大豆以及擬南芥的SOC1 等的親緣關系較遠，與茶樹的SOC1-like isoform X1 和X2、煙草SOC1-like、河岸葡萄和蓖麻的SOC1 的親緣關系更遠，說明油茶CoSOC1-like 具有獨特的序列特征。由于茶樹CsSOC1-like 具有調節(jié)茶樹開花時間作用[35]，因此，推測油茶CoSOCl-like 也能夠調節(jié)油茶的開花時間。

植物的SOC1-like基因的功能具有多樣性。苜蓿的SOC1-like基因MtSOC1a不僅可以促進開花，還可以促進主莖的伸長[36]；過表達矮牽牛的SOC1-like基因能夠促進煙草的花瓣和葉片的光合作用，并增強煙草對高溫的耐受性[37]。基因表達分析結果表明，CoSOC1-like基因在油茶不同發(fā)育階段的營養(yǎng)器官和生殖器官中都有表達，這一個特點與松樹中SOC1-like基因MADS11的表達類似[38]。CoSOC1-like基因在花芽生理分化期、雌雄蕊形成期和子房花藥形成期的花芽中的相對表達量最多，在根、莖、葉、頂芽、營養(yǎng)芽、幼果、種子中都有一定量的相對表達量，這個特點與核桃MADS-like基因在花芽中的相對表達量最高相似，但是又不同于核桃的根、莖、葉中相對表達量很低的特點[39]；在子房和花藥形成期的果皮和種子中CoSOC1-like的相對表達量低，這與梅花PmSOC1-like基因在果實和種子中相對表達量低一致[40]。在開花后期，CoSOC1-like基因在根和莖中相對表達量較多，在葉片、營養(yǎng)芽、花瓣、雄蕊和柄托雌等部位表達水平相當。說明油茶CoSOC1-like基因除了參與油茶的花芽分化以外，還可能參與油茶的根、莖、葉和種子等其他器官的生長發(fā)育過程。這些研究結果為進一步研究CoSOC1-like基因在油茶中的成花機理奠定了基礎。

4 結論

本研究成功克隆了油茶的CoSOC1-like基因。CoSOC1-like 蛋白定位于細胞核，含有MADS-box、K-box、I 區(qū)和C 區(qū)，屬于典型的MIKC 型蛋白的轉錄因子；CoSOC1-like 蛋白與同屬植物茶樹的CsSOC1-like 的親緣關系最近。CoSOC1-like基因在油茶的生理分化期、雌雄蕊形成期、子房和花藥形成期的花芽中相對表達量最高，在果皮和種子中的相對表達量較低，說明CoSOC1-like基因在油茶的花芽分化中有重要的調節(jié)作用。本結果為進一步研究油茶CoSOC1-like基因的功能奠定了理論基礎，為后續(xù)應用轉基因技術調控CoSOC1-like基因表達水平來調節(jié)油茶花期提供了理論依據。