李子蜂花粉中黃酮苷及酚胺類化合物鑒定

張勇 王莉 喬江濤

（1江蘇蜂奧生物科技有限公司，泰州225312；2江蘇鴻祺生物科技有限公司，泰州225312；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

花粉是顯花植物花藥產(chǎn)生的雄性生殖細(xì)胞，通常由蜜蜂、蝴蝶、飛蛾、蜂鳥等傳粉者傳遞到雌花的柱頭上[1]。蜜蜂是水果、蔬菜、花卉和農(nóng)作物最重要的傳粉者，世界上超過(guò)三分之一的農(nóng)作物生產(chǎn)依賴于蜜蜂授粉[2]。花粉提供了蜂群生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)，還有助于蜜蜂降低對(duì)殺蟲劑的敏感性，增強(qiáng)蜜蜂的免疫功能，并幫助蜜蜂對(duì)抗病原體，如微孢子蟲、細(xì)菌和病毒[3]。

由于蜂花粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性，它已經(jīng)在人類的飲食中使用許多世紀(jì)。近年來(lái)，蜂花粉作為人類膳食補(bǔ)充劑被廣泛應(yīng)用于食品加工中[3]。建議每天攝入花粉，因?yàn)樗鼘?duì)人體健康有益，如有助于減緩衰老過(guò)程，降低膽固醇水平，調(diào)節(jié)腸道功能，對(duì)心血管系統(tǒng)、皮膚和視力有好處，而且具有抗生素、抗癌和抗氧化生物活性。花粉在醫(yī)學(xué)上最重要的用途是它對(duì)前列腺疾病的預(yù)防和治療作用[4]。蜂花粉作為前列腺疾病的主流藥物，從1988年開始在中國(guó)市場(chǎng)廣泛使用。蜂花粉的這些功能特性主要是由于其含有多種生物活性化合物，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、粗纖維、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和脂肪酸，以及植物次生代謝產(chǎn)物。植物化學(xué)物質(zhì)作為植物的代謝物，廣泛存在于蜂花粉中[1]。以往的研究主要集中在花粉中的酚酸和黃酮類化合物，尤其是對(duì)香豆酸、山奈酚、槲皮素和異鼠李素等具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗糖尿病、抗癌和抗氧化等[5]。近年來(lái)，蜂花粉中的另一種生物活性物質(zhì)多胺逐漸引起人們的關(guān)注。多胺通常在花粉中與羥基肉桂酸結(jié)合。這些成分通常被命名為羥基肉桂酸酰胺（HCAA）衍生物或酚酰胺。蜂花粉中的酚酰胺具有結(jié)構(gòu)多樣性的特點(diǎn)，其主要成分是酚類物質(zhì)（對(duì)香豆酸、阿魏酸和咖啡酸）與脂肪族或芳香族胺結(jié)合，如腐胺、精胺和亞精胺[6]。然而，不同植物的花粉代謝途徑不同，造成酚酰胺的種類不同的單花蜂花粉中表現(xiàn)出很大的差異。

本文采用高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight-mass spectrometry,HPLC-QTOF- MS），對(duì)李子蜂花粉中的黃酮苷和酚胺類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定為蜂花粉的生物活性及藥理學(xué)作用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

分析級(jí)甲醇、無(wú)水乙醇、甲酸購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙酸，質(zhì)譜級(jí)乙酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

李子蜂花粉樣品于2020年采自廣西，樣品采集后存放于4℃冰箱備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；無(wú)菌注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司）；0.22μm 微孔濾膜（Milipore 公司）；移液器（美國(guó)Thermo Fisher公司）；數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；LC-6AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；高效液相色譜儀和6520 四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)Agilent 公司）；JECHERS自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；

1.4 方法

1.4.1 蜂花粉樣品前處理

準(zhǔn)確稱取3g蜂花粉置于50ml離心管中， 75%乙醇溶解并定容至30ml。自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)條件：頻率120Hz，運(yùn)行時(shí)間60s。蜂花粉懸濁液配平后在6000r/min條件下離心5min，取上清過(guò)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，用于HPLC分析。

1.4.2 高效液相色譜分析條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18(150 mm×4.6 mm, 5μm)；流速：0.65 ml/min；流動(dòng)相A：0.2%乙酸水流動(dòng)相B：2%乙酸甲醇，進(jìn)樣量為10μl、檢測(cè)波長(zhǎng)270nm；柱溫箱溫度為38℃。

梯度洗脫程序?yàn)椋?～10min，10%～22% B；10～16min，22%～28%B；16～30min，28%～31%B；30～47min，31%～34%B；47～75min，34%～43%B；75～108min，43%～45%B；108～110min，45%～51%B；110～145min，51%～59%B；145～150min，59%～80%B。

1.4.3 樣品質(zhì)譜分析條件

液相質(zhì)譜（LC-QTOF）分析條件：離子源為ESI源（電噴霧），離子源噴射電壓為4kV，出口電壓為130V、加熱的溫度350℃、氮?dú)猓∟2）流速為11L/min、碰撞氣體為氦氣、霧化氣流速為80kPa、霧化器的壓力40psi、質(zhì)量掃描范圍m/z =100～900Da。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉高效液相色譜圖

李子蜂花粉提取物經(jīng)HPLC分離結(jié)果如圖2所示，從圖中，可以清楚的看到油菜蜂花粉中所含物質(zhì)豐富，出峰時(shí)間緊湊，分別 在25min、40min和105min 成簇出現(xiàn)，對(duì)圖1所示所有峰進(jìn)行出峰時(shí)間和紫外光譜對(duì)比。根據(jù)文獻(xiàn)查閱對(duì)比、HPLC-MS鑒定數(shù)據(jù)對(duì)比及標(biāo)品驗(yàn)證，對(duì)圖1標(biāo)注結(jié)果化合物1和化合物2進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表1。

圖1 李子蜂花粉

表1 正離子模式下李子蜂花粉中化合物信息

2.1.1 化合物 1結(jié)構(gòu)解析

圖3及表1為化合物正離子模式下二級(jí)質(zhì)譜圖，可知化合物1的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 641.3537，化合物1的分子量為640Da。通過(guò)比對(duì)圖2二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)斷裂碎片，進(jìn)一步推測(cè)化合物裂解途徑論證該化合物結(jié)構(gòu)，其表現(xiàn)為顯著的多酚類化合物的電離特征。準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+（m/z）在斷裂1個(gè)葡糖苷（C6H5O10）碎片后，產(chǎn)生分子離子碎片峰[M+H]+m/z 479.1346，而后在第二次相繼斷裂1個(gè)葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子離子碎片峰 [M+H]+m/z 317.0770，最終得到相對(duì)分子質(zhì)量317Da即為異鼠李素相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)合紫外光譜，化合物1在328nm、354nm處有最大吸收峰，符合多酚類紫外吸收特征。化合物我們最終鑒定為異鼠李素-3-O-龍膽二糖糖苷。

圖2 李子蜂花粉HPLC 譜圖

圖3 正離子模式下化合物1的質(zhì)譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.2 化合物2結(jié)構(gòu)解析

圖4及表1為化合物正離子模式下二級(jí)質(zhì)譜圖，可知化合物2的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 611.1531，因此化合物2的分子量為610 Da。通過(guò)比對(duì)圖4二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)斷裂碎片，進(jìn)一步推測(cè)化合物裂解途徑論證該化合物結(jié)構(gòu)。其表現(xiàn)為顯著的多酚類化合物的電離特征。準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(m/z)在斷裂1個(gè)葡糖苷（C6H5O10）碎片后，產(chǎn)生分子離子碎片峰[M+H]+m/z 449.1024，而后在第二次相繼斷裂1個(gè)葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子離子碎片峰 [M+H]+m/z 287.0510，最終得到相對(duì)分子質(zhì)量288Da即為山奈酚相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)合紫外光譜，化合物2在348nm處有最大吸收峰，符合多酚類紫外吸收特征。化合物我們最終鑒定為山奈酚-3-O-槐糖苷。

圖4 正離子模式下化合物2的質(zhì)譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.3 化合物3、4、5、6結(jié)構(gòu)解析

從表1中可知，化合物 3、4、5和6相對(duì)分子質(zhì)量相同，均為583，四個(gè)峰二級(jí)質(zhì)譜斷裂相同，表明四個(gè)化合物為異構(gòu)體。由圖5可知道，準(zhǔn)分子離子峰584m/z[M+H]+在斷裂一個(gè)香豆酰碎片（-146）后，產(chǎn)生碎片離子438m/z[M+H]+，而后繼續(xù)斷裂一個(gè)香豆酰碎片（-146）產(chǎn)生碎片離子292m/z[M+H]+。此外，四個(gè)化合物的保留時(shí)間之間增長(zhǎng)，最大紫外吸收逐漸增大，表明四個(gè)化合物可能是順反異構(gòu)體。由于反式香豆酰屬于平面型結(jié)構(gòu)，雙鍵與處于同一平面的苯環(huán)容易形成Π-Π共軛。對(duì)于順式香豆酰，由于空間位阻，造成雙鍵與苯環(huán)處于非平面，不易發(fā)生共軛，而順式與反式的紫外最大吸收波長(zhǎng)略有不同，與順式相比，反式的最大吸收波長(zhǎng)位于長(zhǎng)波端。另外，順式異構(gòu)體是兩個(gè)電負(fù)性相同的原子或原子團(tuán)處在分子的同側(cè)，造成偶極矩的疊加，增加不對(duì)稱性，不像反式那樣比較對(duì)稱地排列，因而順式分子的偶極距比反式大，為偶極分子，有較弱的極性。

圖5 正離子模式下化合物6的質(zhì)譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

圖6 化合物6的質(zhì)譜斷裂圖

最后化合物峰3、4、5、6分別被鑒定為順, 順, 順-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、順,順, 反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、反, 順, 反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺和反, 反, 反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺。化合物6的質(zhì)譜斷裂規(guī)律。

3 討論與結(jié)論

本研究采用HPLC-QTOF-MS法，從李子蜂花粉中鑒定出2個(gè)黃酮苷類化合物，分別是異鼠李素-3-O-龍膽二糖苷和山奈酚-3-O-槐糖苷。此外首次從李子蜂花粉中鑒定出4個(gè)酚胺類成分，分別是 順, 順, 順-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、順, 順, 反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺、 反, 順, 反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺和反,反, 反-三-對(duì)-香豆酰亞精胺。本研究對(duì)李子蜂花粉的功能活性研究提供理論參考。