多肽原料藥的分析和表征

王二琴

（上海昂博生物技術有限公司 上海 201417）

多肽的相對分子質量介于典型的有機小分子和高分子化合物之間。一般來說，多肽是由≤50 個氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物。多肽廣泛存在于人體內，并具有重要的生理效能，而多肽類藥物也早已用于臨床治療糖尿病和某些癌癥等[1]。隨著多肽類藥物的不斷出現，多肽相關的分析檢測研究的重要性亦日益凸顯[2]。

質量是保障藥品安全性和有效性的基礎。在制藥企業按藥品生產質量管理規范要求進行多肽原料藥生產時，如果沒有嚴格的分析、表征和雜質檢測，產品就會出現問題并可能造成非常嚴重的后果。本文概要介紹多肽原料藥的分析、表征及其檢測項目。

1 指導原則

質量控制部門是藥品質量控制的重要組成部分，產品的各項檢測結果只有符合預先制定的指標才能放行。對于原料藥，人用藥品注冊技術要求國際協調會發布的協調指導原則Q7 部分論述了需要進行的檢測項目和建立規范標準的過程。

隨著市場上多肽類藥物越來越多，藥品監管機構必須確立各種多肽原料藥的質量控制參數。為了確保生產的藥品的高質量和一致性，多肽原料藥的分析和表征必須考慮采用多項質量控制參數，以確保藥品質量保證部門能夠在放行產品之前充分評估產品的質量。

2007 年10 月，國家食品藥品監督管理局發布了《合成多肽藥物藥學研究技術指導原則》，后者結合國內對多肽藥物研究和評價的實踐經驗，對多肽藥物各項藥學研究提出了一般性要求。多肽原料藥的質量與其生產工藝關系密切，且即使源自同一生產工藝的產品，不同生產批次的產品的質量也可能不同[3]。因此，多肽原料藥的結構完整性表征和質量檢測至關重要。下面從鑒別、檢驗（純度）、含量測定和其他一般屬性檢測幾個方面來介紹多肽原料藥的分析和表征。

2 分析和表征

2.1 鑒別

鑒別主要是為了確認多肽的結構，即確認產品的身分同一性。多肽的鑒別不是簡單、單一的檢測就能完成的，其一級結構的確證一般采用質譜測定相對分子質量，色譜測定氨基酸組成，質譜結合酶切或采用Edman 降解測定肽序[4]。Edman 降解是一種傳統的、有效的肽序測定方法，但一般不適用于氨基末端封閉或呈環狀的多肽；質譜檢測的多肽所含的氨基酸個數通常不宜超過25 個，否則會導致數據解析困難。多肽的二級結構實際上是肽鏈因氫鍵而形成的局部結構，其確證一般有X 射線單晶衍射、核磁共振、紅外、紫外、圓二色譜等檢測方法。多肽結構的鑒別常用到且不限于上述檢測方法。由于每種檢測方法只能獲得多肽結構的一些特定信息，故采用正交表征方法是確保能夠準確鑒別多肽二級結構的關鍵[5]。一般而言，采用磁共振、紅外、紫外檢測和進行氨基酸組成分析即可獲知短肽的結構特征，但對于中、長肽，則還需要進行氨基酸序列分析并結合質譜檢測來確證肽序的準確性，即需要進行更多的檢測和分析并對所得信息進行綜合解析與歸屬。必須指出的是，如果能夠得到多肽標準品，可將多肽待檢品與標準品的光譜圖進行比對，由此大大簡化和方便多肽的鑒別。多肽的鑒別需要設定哪些檢測指標，取決于多肽的生產工藝、鏈長特點及其與檢測方法的匹配度。根據藥典的要求，鑒別中提到的“檢測”必須能夠達到檢測的目的。

2.2 檢驗（純度）

檢驗（純度）部分主要用來限制有關物質中的雜質，檢測多肽的純度和完整性。除目標肽外，其他的肽均可視為雜質，主要包括與目標肽結構相似的工藝相關雜質和降解產物、聚合物、殘留溶劑、主成分離子、水分等。工藝相關雜質是指在多肽合成生產過程中產生的相關雜質。如在多肽合成生產過程中，為了防止發生不希望的側鏈反應，會引進許多側鏈保護基，而后又會根據需要清除側鏈保護基。由于這些化學反應不是100%的完全反應，故最后側鏈保護基仍可能附著于目標肽上，導致多肽相關物質的出現。另外，無論生產工藝如何，由于化學不穩定性，多肽的降解產物都可能會產生。多肽一般通過水解、氧化、外消旋化等不同機制[6]而產生降解產物。

高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography， HPLC）是用于多肽及其相關雜質的鑒別、分離和定量的主要方法[7]，雜質能否被檢出、分離和鑒別是衡量所用方法好壞的重要依據之一。在執行藥品生產質量管理規范的制藥企業中，質量控制部門也需負責開發產品分析方法并隨后進行驗證以確保其準確性。通常，對于第一批生產的多肽原料藥，HPLC 純度要求不低于97%，同時要求其他單一雜質含量不超過1%。藥典中的多肽原料藥一般都有規格和雜質限度要求。雜質可以指定或不指定，取決于它們存在的含量。雜質的限度應大于其檢出限度，報告格式一般為“不超過”。

聚合物是由于產品物理不穩定性而導致的通過表面吸附、聚集或沉淀所產生的雜質，一般通過排阻色譜法檢測單體和聚合物的含量。元素和有機試劑雜質往往來自產品合成和純化工藝中所使用的材料、試劑和設備的浸出等。人用藥品注冊技術要求國際協調會發布的協調指導原則Q3D 和Q3C 部分分別論述了產品在不同給藥途徑時需要檢測的元素雜質和殘留溶劑的類型及限度。

關于有關物質的分析方法及其檢測限度可依據國家食品藥品監督管理局有關部門2004 年發布的《化學藥物雜質研究的技術指導原則》進行研究和確定，所采用的分析方法必須能夠有效分離工藝相關雜質、降解產物和聚合物等。一般需要對兩種以上的分析方法進行比對研究。需要指出的是，對于多肽，不同色譜柱的洗脫效能差異很大。目前市場上有很多多肽分析色譜柱，如選用得合適，可以明顯改善多肽原料藥的雜質分離度。

對多肽主成分離子（如醋酸根、鹽酸根和三氟乙酸根）及水分的檢測，反相色譜法和離子交換色譜法是最常用的方法。反相色譜法主要用于檢測三氟乙酸根和醋酸根，但其檢測范圍較窄，且雜質峰多而明顯，分離效果可能不佳。不過，反相色譜柱能耐受有機溶劑，故對水不溶的多肽樣品，可先添加少量有機溶劑溶解，然后再用反相色譜法進行檢測。相比之下，離子交換色譜法一般不能使用有機溶劑，否則會損害色譜柱的。當然，有些情況下可以改用特殊的離子交換色譜柱。

水分測定多用卡爾·費休滴定法。水份不僅是產品放行的重要指標，也是產品穩定性試驗中常用的考察指標。卡爾·費休滴定法可按原理分為庫侖滴定法和電位滴定法，其中庫侖滴定法靈敏度高，適用于痕量水分檢測，對于含量偏高的水分檢測，則耗時較長。可根據多肽原料藥的親疏水性來選用不同的水分測定方法。藥典也依據多肽的親疏水性，給出了水份不超過3% ～ 14%的規定。

2.3 含量測定

含量（效價）測定是評價多肽原料藥質量的主要指標之一。藥典中通常采用比較色譜法（樣品稱重時須在有溫度和濕度控制的條件下進行）來測定，以確定的化學對照物質為標準，但必須有足夠的定量對照標準品（其本身必須經過全檢分析）。指標通常以無醋酸或無水多肽表示。這種檢測的允許限度通常是非對稱的，上限為100%＋允許的試驗重復性（通常是2.0%），下限為100%－（允許的試驗重復性＋最大允許雜質水平）[8]。采用比較色譜法的前提是必須有足夠的定量對照標準品。

多肽的含量測定也可很容易地由氨基酸組成分析結果來確定，通過計算檢測到的每種氨基酸的摩爾含量得到樣品的總質量。這種方法的缺點是在多肽水解過程中有些氨基酸如色氨酸等可能會被破壞而導致檢測結果不準確。其他方法包括通過元素分析進行氮測定、凱氏定氮分析和在HPLC 檢測中使用氮特異性檢測器等，但這些方法對氨基酸衍生氮沒有特異性，容易產生系統誤差。

2.4 其他檢測

除了上述重要的質量屬性之外，質量控制還須考慮是否需要檢測產品的其他屬性，如一般屬性，包括外觀、色澤、溶解度、澄清度、酸堿度、可見異物、旋光性和質量平衡等。這些屬性都是多肽原料藥質量控制的一般要求，同時也能證明產品批與批間的一致性。溶液的澄清度及其色澤、酸堿度是原料藥質量控制的重要指標，通常應做此兩項檢查，特別是對注射用多肽原料藥。此外，大多數多肽通過注射或口服給藥，故有微生物和內毒素檢測要求。

從質量平衡的角度講，多肽原料藥的檢測應該對其多肽、主成分離子和水分含量之和進行控制，一般要求控制在100%±5%，以確保沒有大量的無機鹽或其他不明雜質的存在[9]。

3 小結

對于多肽原料藥生產，建立全面、可靠的質量控制指標是建立可重復的生產工藝的必要前提。上述鑒別、檢驗（純度）、含量測定和一般屬性檢測是多肽原料藥全檢的必要組成。根據不同多肽的不同生產工藝，多肽原料藥的分析、表征內容可適當調整。多肽原料藥只有通過了所有的預定質量檢測后才能被放行使用。