NF-κB在心肌缺血再灌注損傷中的作用

楊濤 蔣艷

摘要： 目的 探究NF-κB在心肌缺血再灌注損傷中的作用。方法 選取60只雌性小鼠隨機分為四組每組各15只，分為假手術組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、慢病毒對照（Ad-nc）組、慢病毒（Ad-SNHG1）組，所有小鼠再灌注損傷4h后處死小鼠，HE染色分析心肌組織病理變化，并選擇Western blot分析心肌組織NF-κB信號通路變化，酶聯免疫吸附測定小鼠外周血及心肌組織炎癥水平。結果 慢病毒（Ad-SNHG1）組心肌NF-κB、血液HMGB-1、IL-10、Tn-1、P-NF-kBp65、TLR4免疫組化評分顯著高于其他三組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 心肌缺血再灌注損傷后NF-κB激活并釋放大量炎癥因子，增加心肌細胞負擔。

關鍵詞：核因子-κB;心肌缺血;灌注損傷

【中圖分類號】R542.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）06--01

急性心肌梗死為臨床常見心血管疾病類型，隨著溶栓、經皮冠狀動脈介入治療展開，心肌梗死致死率得到顯著改善，但心肌梗死后缺血再灌注損傷成為新的難題[1]。核因子-κB（NF-κB）作為細胞中關鍵轉錄調節因子，刺激因子如脂多糖、病毒或腫瘤壞死因子等的活化誘導多種基因表達，產生多種細胞因子參與機體炎癥反應[2]。分析心肌缺血再灌注損傷后NF-κB活性及炎癥因子變化，對有效干預心肌缺血再灌注損傷具有良好指導作用。文章就建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，分析NF-κB及相關炎癥因子變化，具體如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

健康雌性C57BL/60小鼠60 只，12周大，20～22g，清潔級。由桂林醫學院動物實驗中心提供（編號：62000700001045）。采取隨機數字表法隨機分為四組各15只，假手術組（Sham組）：實驗時只扎線，不結扎、缺血再灌注組（I/R組）：結扎冠狀血流30分鐘，放松結扎線進行再灌注2小時，造成I/R損傷、慢病毒對照（Ad-nc）組：術前7d、2d尾靜脈注射對照慢病毒，然后結扎冠脈造I/R損傷模型、慢病毒（Ad-SNHG1）組：術前7d、2d尾靜脈注射Ad-SNHG1慢病毒，然后結扎冠脈造I/R損傷模型。

1.2 方法

1.2.1心肌缺血再灌注模型構建

將小鼠（C57BL/6，12周大）稱重后，2.5%戊巴比妥麻醉。將小鼠仰臥位固定于手術操作臺上。剪去頸部體毛，剪開頸部皮膚分離組織，氣管切開連接小動物呼吸機，潮氣量250 mL/min，呼吸頻率120次/min。碘伏消毒，胸骨正中偏左側切口分離肌肉，剪斷第3-4根肋，用于胸器撐開胸骨，暴露小鼠心臟。提起包壁層剪開心包，暴露左心耳，在左心耳與肺動脈圓錐之間，找到行走于也肌內與也大靜脈走向一致的冠狀動脈前降支處進針，5-0無創縫合線穿過，進針深度為0.3-0.5 mm，在肺動脈圓錐旁出針。術中用針形電極連接小鼠四肢，心尖區表面的蒼白表示缺血成功，心肌梗死模型的建立成功。120 min后松解結扎線，行再灌注，實驗過程中維持機械呼吸支持。Sham組小鼠手術操作與上述基本相同，僅將縫合針穿線過左冠狀動脈前降支，但不結扎該血管。

1.2.2心肌組織核質分離

取出生1-3天新生小鼠處死，心室剪碎至體積1mm3左右的顆粒，15 mL離心管中加入1 mL 0.1% II型膠原酶、0.2%胰酶混合液（1：1），37℃消化10 min輕輕吹打靜置1分鐘，收集上清液放置50 mL離心管，加入DMEM/F12+10%FBS培養基，重復6～7次直至組織消化成絮狀沉淀物。收集細胞接種于35 mm的無菌培養皿中，培養30 min。上清液中的細胞再次貼壁45 min，仍懸浮的細胞接種于涂有明膠的培養皿中培養24 h，得到跳動的心肌細胞。

1.2.3Western blot分析蛋白表達

提取細胞蛋白和細胞核蛋白添加上樣緩沖液，依據說明書操作作NF-KBp65（Ser536）、IkBa（Ser32）等蛋白表達水平，內參選擇LaminB和Tubulin。

1.2.4血液樣本處理

四組小鼠建模前及建模后4h分別經尾部取血，將12000rpm/min離心10min（離心半徑8.2cm），將血清部分轉移至新的離心管，用于ELISA檢測。

1.2.5心肌組織細胞提取物制備

取四組小鼠心肌組織各0.1g并剪碎，放入放射免疫沉淀法組織裂解液200ul，在組織勻漿儀上勻漿，在冰上靜置30min，1200×g，上清轉移至新的離心管，用于ELISA檢測組織炎癥因子。

1.2.6ELISA分析炎癥因子水平

取96孔板，設置標準品及待測樣品孔，加入分離獲取血清和組織上清液10ul，待測樣本孔中添加辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100ul，依據說明書孵育、洗滌操作。終止反應后于酶標儀492nm處測定隔空吸光度值，依據樣品OD值，計算各樣本濃度值。

1.3 統計學處理

使用GraphPad Prism v6.0和SPSS 18.0進行統計學數據分析，所有數據均以SD（標準差）表示。采用t檢驗分析兩組間的差異，采用單因素方差分析和Dunnett多重比較檢驗區分三組或三組以上的差異。

2 結果

2.1四組小鼠心肌NF-κB水平比較

慢病毒（Ad-SNHG1）組心肌NF-κB水平顯著高于其他三組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2四組大鼠血漿中各ELISA指標含量分析

慢病毒（Ad-SNHG1）組HMGB-1、IL-10、Tn-1水平顯著高于其他三組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3四組小鼠心臟組織免疫組化評分結果

慢病毒（Ad-SNHG1）組P-NF-kBp65、TLR4免疫組化評分顯著高于其他三組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

缺血再灌注損傷所致組織損傷為一種與抗原無關炎癥過程，病理生理十分復雜。既往研究指出[3]，氧化應激反應在缺血再灌注損傷病理過程中發揮著關鍵作用。缺血再灌注會引起無菌性炎癥，獲得性和固有免疫系統均被激活，如模式識別受體激活、炎癥細胞浸潤。

NF-κB則作為一種能特異的與免疫球蛋白的增強子KB序列結合的核蛋白轉錄因子，具有Rel同源結構域，是Rel蛋白家族成員。未活化狀態下，NF-κB與抑制因子結合并形成NF-κB/IκB復合物，處于失活狀態，定位于細胞質中。但經過外界刺激下會產生活性氧、細胞因子等。本次研究中指出，通過建立四組模型組，其中慢病毒（Ad-SNHG1）組NF-κB信號通路處于最高水平。主要是建模后，磷酸化NF-κBp65和磷酸化IκBa水平顯著增加，p65蛋白大量進入細胞核，IκBa磷酸化水平增加，處于高激活狀態，顯著增加心肌缺血再灌注后NF-κB活性。同時，針對血清、免疫組化中相關指標分析后，心肌慢性損傷缺血再灌注后炎癥因子、P-NF-kBp65、TLR4顯著偏高，表明炎癥因子作用下會造成心肌損傷。

綜上所述，心肌缺血再灌注損傷后NF-κB激活并釋放大量炎癥因子，增加心肌組織損傷。

參考文獻：

[1]戴文琴，黃縣立，汪愛萍，等.小鼠心肌缺血再灌注損傷后NF-κB磷酸化狀態及炎癥因子的表達水平[J].國際免疫學雜志，2020，43（1）：26-30.

[2]韋皓，許玉霞，秦莉，等. HIF-1α通過TLR4/NF-κB信號通路對心肌缺血-再灌注大鼠心肌損傷的保護機制分析[J].臨床和實驗醫學雜志，2019，18（10）：1017-1020.

[3]袁泉，夏中元，趙博，等. NF-κB在Jak2/STAT3通路增加大鼠心肌缺血再灌注致腦損傷中的作用[J].醫學研究雜志，2018，47（7）：55-58.