43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑的HPLC分析

王思威， 常 虹， 王瀟楠， 孫海濱， 劉艷萍

(廣東省農業科學院 植物保護研究所，廣東省植物保護新技術重點試驗室，廣東 廣州 510640)

1 前言

氟吡菌酰胺是拜耳公司開發的吡啶乙基苯酰胺類殺菌劑，主要用于防治蔬菜、水果等作物的病害，作用機理為琥珀酸脫氫酶抑制劑[1-3]。肟菌酯屬甲氧基丙烯酸脂類殺菌劑，具有高效、廣譜、保護、治療、鏟除、滲透、內吸活性、耐雨水沖刷、持效期長等殺菌特性，對幾乎所有真菌綱(子囊菌綱、擔子菌綱、卵菌綱和半知菌類)病害如白粉病、銹病、潁枯病、網斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性[4-5]。43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑(商品名露娜森)是由拜耳公司研發的氟吡菌酰胺和肟菌酯復配混合制劑，可同時抑制真菌孢子萌發、芽管伸長、菌絲生長和產孢，與其他殺菌劑不易產生交互抗性，被廣泛用于果樹、蔬菜上病菌的防治，應用前景廣闊。

目前，35%氟吡菌酰胺·戊唑醇懸浮劑、41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑、75%肟菌酯·戊唑醇水分散粒劑等的分析方法有相關報道[3，5-6]，但關于氟吡菌酰胺和肟菌酯混配制劑的分析方法未見公開報道。本文采用高效液相色譜法對試樣中氟吡菌酰胺和肟菌酯進行定量分析，該方法操作快速、簡便，分離度和精密度均能滿足定量分析要求。

2 試驗部分

2.1 試劑和溶液 乙腈：色譜純；水：超純水；氟吡菌酰胺標準品純度為99.2%(CHEM SERVICE)；肟菌酯標準品純度為99.5%(CHEM SERVICE)；43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：島津LC-20A，帶可變波長紫外檢測器和自動控溫進樣器；色譜柱WondaSil C18-WR(150mm×4.6mm，5μm)；過濾器：微孔濾膜，孔徑0.22μm。

2.3 高效液相色譜操作條件 流動相：乙腈-水(體積比60：40)；柱溫：35℃；流速：1mL/min；檢測波長：220nm；進樣量：10μL；氟吡菌酰胺保留時間5.67 min，肟菌酯保留時間14.42min。

典型的氟吡菌酰胺、肟菌酯以及43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑試樣液相色譜圖(圖1～2)。

圖1 氟吡菌酰胺和肟菌酯標樣液相色譜圖

圖2 43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑液相色譜圖

2.4 測定步驟

2.4.1 標樣溶液的配制 分別準確稱取氟吡菌酰胺和肟菌酯標樣0.05g(精確至0.000 2g)于不同的50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲振蕩5min，定容至刻度，搖勻。用移液管移取上述溶液5mL于25mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，備用。

2.4.2 試樣溶液的配制 準確稱取0.1g(精確至0.000 2g)樣品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲振蕩5min，稀釋至刻度，搖勻備用。

2.4.3 測定 在上述操作條件下，待儀器基線穩定后，連續注入數針標樣溶液，待相鄰2針氟吡菌酰胺和肟菌酯標樣溶液的峰面積相對變化<1.5%時，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

2.4.4 計算 將測定的2針試樣溶液及試樣前后2針標樣溶液中氟吡菌酰胺和肟菌酯的峰面積分別平均。氟吡菌酰胺和肟菌酯的質量分數ω(%)按式(1)計算。

(1)

式中：A1為標樣溶液中氟吡菌酰胺或肟菌酯峰面積的平均值；A2為試樣溶液中氟吡菌酰胺或肟菌酯峰面積的平均值；m1為氟吡菌酰胺或肟菌酯標樣的質量，g；m2為試樣的質量，g；P為標樣中氟吡菌酰胺或肟菌酯的純度，%；5為標樣溶液的稀釋倍數。

3 結果與討論

3.1 檢測波長的選擇 使用島津LC-20A的PDA檢測器將波長掃描范圍調整為190～400nm，對氟吡菌酰胺和肟菌酯標樣進行3D譜圖掃描，得到氟吡菌酰胺和肟菌酯的紫外吸收光譜圖。氟吡菌酰胺在220nm處有較大紫外吸收，肟菌酯在254nm處有較大紫外吸收，(圖3)為220nm和254nm譜圖比較。綜合考慮氟吡菌酰胺和肟菌酯峰型、響應值等因素，選擇220nm作為檢測波長。

圖3 不同波長譜圖比較

3.2 流動相的選擇 選用WondaSil C18-WR反相色譜柱作為分離柱，分別比較甲醇-水和乙腈-水作為流動相對試樣進行檢測分析，結果發現，用乙腈-水作為流動相，試樣的峰型對稱性更好、基線更平穩，更能準確定量分析。

3.3 線性相關性試驗 將氟吡菌酰胺和肟菌酯配制成5個系列質量濃度的標準溶液，按照上述2.3的色譜操作條件分析，測定其峰面積，每個質量濃度測定3次，取平均值。以氟吡菌酰胺和肟菌酯的質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到氟吡菌酰胺的線性方程為y=215 63x-2 814.4，線性相關系數為0.999 2(圖4)；肟菌酯的線性方程為y=506 73x-7 335.8，線性相關系數為0.999 2(圖5)。

圖4 氟吡菌酰胺線性關系圖

圖5 肟菌酯線性關系圖

3.4 方法精密度試驗 從43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑中稱取5份試樣，在2.3色譜操作條件下進行分析并取平均值、相對標準偏差(RSD)和變異系數(CV)。結果表明：氟吡菌酰胺的RSD為0.063，CV為0.29%；肟菌酯的RSD為0.091，CV為0.42%(表1)。

表1 分析方法精密度試驗結果

3.5 方法準確度試驗 稱取5份含量的43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑，置于50mL容量瓶中，分別加入一定量氟吡菌酰胺和肟菌酯標準溶液，在上述色譜操作條件下進行測定，氟吡菌酰胺的平均回收率為100.28%，肟菌酯的平均回收率為100.24%(表2)。

表2 分析方法準確度試驗結果

3.6 特異性鑒定 按照2.4.1和2.4.2中方法分別配制標準溶液和樣品溶液，按標準中方法對氟吡菌酰胺和肟菌酯進行全波段掃描、峰純度分析，特異性典型譜圖(圖6)。從譜圖可知，氟吡菌酰胺和肟菌酯在該分析方法下對紫外光有較強的吸收信號。從色譜圖中可以清晰看出，有效成分氟吡菌酰胺和肟菌酯出峰處無其他物質干擾，符合定量分析要求。

圖6 特異性鑒定(A為氟吡菌酰胺；B為肟菌酯)

3.7 非分析物干擾實驗 助劑輔料中干擾物質存在會導致分析方法出現系統偏差，因此，在評價準確度時，需要開展非分析物干擾實驗。配制相應空白溶劑溶液、原藥溶液、標樣溶液及制劑試樣，不含助劑的氟吡菌酰胺和肟菌酯的原藥按照標準規定的方法進行液相色譜分析(圖7～10)，不存在與有效成分的保留時間重合的其他非分析物。因此，按照2.3分析方法分析有效成分，無明顯雜質干擾。

圖7 空白溶劑色譜圖

圖8 不含助劑的原藥色譜圖

圖9 標樣色譜圖

圖10 試樣色譜圖

4 結論

本試驗建立了測定43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑中2種有效成分含量的分析方法，操作簡便、分離度高、線性好，具有較高的精密度和準確度，適用于該制劑的質量檢測。