2型糖尿病患者中性粒細胞趨化功能受損及可能機制

李林斌，吳冕，楊云稀，邵一鳴，劉璐，黃佳敏，孫炳偉

(南京醫科大學附屬蘇州醫院燒創傷中心，江蘇 蘇州 215004)

2型糖尿病是全球公共衛生問題，其發病率在全球范圍內持續上升[1-2]，感染是其最常見的并發癥之一。研究表明，2型糖尿病對某些特定病原體的易感性增加，其中細菌感染的發病率最高，如骨髓炎、肺炎或蜂窩織炎[3]，這與患者先天性免疫功能受損有關[4-5]。中性粒細胞是先天性免疫細胞中數量最多的，且在先天性免疫反應中第一個到達炎癥部位[6]。2型糖尿病患者血糖升高刺激骨髓增生[7]，引起外周血中性粒細胞數量上升[8]。然而，患者中性粒細胞數量升高，抵御病原體的能力沒有增強，提示患者中性粒細胞功能不全。本研究針對中性粒細胞發揮固有免疫最基本的趨化功能[9]進行分析，旨在為預防和治療糖尿病患者感染性并發癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 倫理聲明

本研究獲南京醫科大學附屬蘇州醫院(蘇州市立醫院)醫學倫理委員會批準(批準號KL901064)。通過健康志愿者和2型糖尿病患者的肘靜脈獲取血液樣本，在入組24 h內采集血樣。在被納入研究之前，所有參與者收到了書面知情同意書。所有的實驗按照批準的指南進行。

1.2 研究對象

本研究為橫斷面研究，納入2020年7月至12月在南京醫科大學附屬蘇州醫院內分泌科住院確診的2型糖尿病患者45例。確診標準為存在典型2型糖尿病癥狀且隨機血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖≥7.0 mmol/L，或葡萄糖負荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L。同期于蘇州市體檢中心招募健康成人志愿者45名。患有感染、白細胞>10×109/L的患者及志愿者排除在外。受試者的臨床特征見表1。

1.3 主要試劑與儀器

Hank平衡鹽溶液(HBSS)、PBS、胎牛血清、RPMI 1640(新西蘭Gbico公司)；Ficoll(瑞典GE公司)；糖基化終產物(AGEs，美國Abcam公司)；FITC標記抗P2X1受體抗體(以色列Alomone公司)；兔源P2X1受體一抗(英國Biorbyt公司)；FITC標記的鏈霉素二抗(中國BIOSS公司)；IX71熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，FACS Canto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)，Zeiss LSM 900共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)。其他試劑如無特殊說明均購自美國Sigma公司。

表1 受試者一般資料及臨床信息 n=45

1.4 中性粒細胞分離

使用含EDTA的采血管收集受試者全血2 mL。1 ∶1加入3%葡聚糖沉降紅細胞20 min。取上清液，離心10 min(400×g，20 ℃)后用1×HBSS(不含Ca2+、Mg2+)重懸細胞。將細胞懸液置于3 mL的Ficoll上，離心35 min(400×g，15 ℃)后棄上清液。沉淀用3 mL蒸餾水吹打30 s裂解紅細胞，加入3 mL 2×HBSS，離心7 min(400×g，20 ℃)。重復裂解2次后獲得純化的人外周血中性粒細胞。純化的中性粒細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640重懸備用。

1.5 中性粒細胞趨化功能分析

使用本課題組改良后的瓊脂糖下趨化模型檢測中性粒細胞趨化功能。 將煮沸的瓊脂糖溶液與50% HBSS(含Ca2+、Mg2+)和50% RPMI 1640(含20% 胎牛血清)的培養基混合制成瓊脂糖凝膠。然后用移液管將2.7 mL溶液移入35 mm培養皿中，在室溫下冷卻至凝固。當瓊脂糖溶液完全凝固時，在凝膠中切出直徑3 mm、相距2.8 mm的3個孔。中間孔填充0.1 μmol/L趨化肽(N-formyl-Met-Leu-Phe fMLP)10 μL，兩側孔填充1×107/mL中性粒細胞10 μL。凝膠在37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h。用IX71熒光倒置顯微鏡在四倍鏡下觀察趨化距離。

為分析趨化圖像，本課題組建立了基于計算機視覺的細胞趨化分析系統。根據趨化距離將趨化區域劃分了3個區，Ⅰ區：<800 μm，Ⅱ區：800～2 000 μm，Ⅲ區：>2 000 μm。設置了3個參數評價中性粒細胞趨化功能：趨化距離、趨化細胞比率、趨化指數。趨化細胞比率(%)=(趨化細胞數/總細胞數)×100%；趨化指數=(Ⅱ區+Ⅲ區細胞數)/總細胞數。

在趨化干預實驗中，用RPMI 1640(含20%胎牛血清)將2型糖尿病患者及健康對照的血漿配制成90%和20%兩組；將AGEs 配制成0.5、1、2和4 mmol/L；葡萄糖配制成5、12、25 mmol/L，25 mmol/L甘露醇為高滲透壓對照組；棕櫚酸配制成50、100和200 μmol/L。將處理后的中性粒細胞(1×107/mL)在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h(葡萄糖及棕櫚酸干預實驗孵育4 h)后用PBS洗滌2次后檢測趨化功能。對照組用單純培養基處理。

1.6 流式細胞術檢測中性粒細胞表面P2X1受體

取純化的人中性粒細胞5×105個(細胞密度為1×107/mL)，按5 μL/100 μL PBS加入FITC標記抗P2X1受體抗體，與中性粒細胞在4 ℃下避光共孵育1 h，用冷PBS洗滌2次后流式細胞術檢測熒光強度。

1.7 免疫熒光檢測中性粒細胞膜表面P2X1受體

將棕櫚酸干預后的中性粒細胞(2×106個)用冷PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.01% Triton X-100滲透30 min，用5%山羊血清封閉1 h，用1 ∶200兔源P2X1受體一抗4 ℃孵育過夜后，1 ∶1 000 FITC標記的鏈霉素二抗室溫避光孵育1 h。在細胞核染色過程中，細胞與DAPI共孵育30 min。染色后，使用共聚焦顯微鏡觀察中性粒細胞。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 2型糖尿病患者中性粒細胞趨化功能受損

與健康對照相比，2型糖尿病患者中性粒細胞趨化距離、趨化細胞比率和趨化指數均明顯下降(t分別為16.19、17.21、16.76，P均 <0.001)。見圖1。

圖1 2型糖尿病患者中性粒細胞趨化功能分析

2.2 2型糖尿病患者中性粒細胞膜表面P2X1受體表達增加

流式細胞術結果顯示，與健康對照比較，2型糖尿病患者中性粒細胞P2X1受體表達水平明顯升高(t=7.60，P<0.001)；對2型糖尿病患者中性粒細胞趨化距離與P2X1受體表達作相關性分析，結果顯示二者呈負相關(r=-0.60,P<0.001)。見圖2。

圖2 2型糖尿病患者中性粒細胞膜表面P2X1受體表達及與趨化距離的相關性

2.3 中性粒細胞趨化功能受損機制分析

2.3.1 2型糖尿病患者高濃度血漿抑制中性粒細胞的趨化功能 90%和20%的患者血漿刺激健康對照中性粒細胞2 h后，3組趨化距離比較總體差異有統計學意義(F=46.75，P<0.001)，90%患者血漿組相較對照組(單純培養基)和20%患者血漿組能明顯抑制中性粒細胞趨化功能(P均<0.001)；而90%和20%的健康對照血漿刺激后，3組趨化距離的差異無統計學意義(F=0.42，P>0.05)。見圖3。

a：P<0.001，與對照組相比；b：P<0.001，與20%患者血漿組比較

2.3.2 葡萄糖、AGEs、棕櫚酸干預后中性粒細胞的趨化功能 在葡萄糖干預實驗中以5 mmol/L組為對照組，12、25 mmol/L組為高濃度葡萄糖組，25 mmol/L甘露醇為高滲透壓對照組。孵育中性粒細胞4 h后結果顯示，4組趨化距離比較總體差異無統計學意義(F=1.47，P>0.05)。

以0.5、1、2和4 mmol/L的AGEs干預健康對照中性粒細胞2 h后，結果顯示5組趨化距離比較總體差異無統計學意義(F=1.03，P>0.05)。

以50、100 和200 μmol/L棕櫚酸干預健康對照中性粒細胞4 h后，4組趨化距離比較總體差異有統計學意義(F=3.52，P<0.05), 200 μmol/L組較對照組明顯抑制中性粒細胞趨化功能(P<0.05)。見圖4。

a：P<0.05，與對照組相比

2.3.3 棕櫚酸促進中性粒細胞P2X1受體高表達 50、100 和200 μmol/L棕櫚酸干預健康對照中性粒細胞后，流式細胞術檢測結果顯示，4組P2X1平均熒光強度比較總體差異有統計學意義(F=2.96，P<0.05)；與對照組相比，高濃度棕櫚酸(200 μmol/L)明顯促進中性粒細胞膜表面P2X1受體高表達(P<0.05)，趨化距離與P2X1表達呈明顯負相關(r=-0.67，P<0.05)。200 μmol/L棕櫚酸干預中性粒細胞4 h，免疫熒光法檢測膜表面P2X1受體表達，結果與流式細胞術一致。見圖5。

A：流式細胞術檢測P2X1受體；B：趨化距離與P2X1表達的相關性；C：免疫熒光檢測P2X1受體(×100)。a：P<0.05，與對照組相比

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病顯著的病理生理學特征。研究表明，大多數胰島素抵抗患者存在肥胖和血脂升高[10-12]，其中肥胖引起的慢性炎癥可能在胰島素抵抗中起到重要作用[13]，炎癥因子通過脂肪和肌肉組織中的IKKβ/NF-κB 和 JNK 通路促進胰島素抵抗的發生[14]。中性粒細胞是先天性免疫細胞中數量最多的[15]，在抗感染中的作用十分重要，其趨化性是指沿著吸引物或排斥物濃度梯度的方向運動的性質[16]。趨化功能正常是中性粒細胞定向遷移至感染部位的前提，趨化功能障礙會造成機體嚴重的免疫功能缺陷[17]。本研究結果表明高濃度棕櫚酸對中性粒細胞的趨化性存在抑制作用，這損害了機體抵御病原體和對炎癥的清除功能，導致機體慢性炎癥發生，加重了患者胰島素抵抗，對2型糖尿病的發生發展有一定的推動作用。

本研究中，2型糖尿病患者的高濃度血漿能明顯抑制中性粒細胞趨化功能。2型糖尿病患者因代謝功能紊亂，血漿中血糖、AGEs[18]、棕櫚酸[19]等物質明顯升高，這些因素均可能是患者中性粒細胞趨化功能受損的原因。然而，高濃度葡萄糖不能明顯抑制中性粒細胞趨化功能。除高濃度葡萄糖對中性粒細胞趨化功能無明顯作用外，另一可能的原因是本實驗干預時間較短。葡萄糖是中性粒細胞的供能物質，短時間的高糖干預甚至可能是中性粒細胞趨化作用的有利因素。然而，中性粒細胞在體外半衰期只有8 h[20]，因此體外實驗很難模擬出2型糖尿病患者體內中性粒細胞長時間受到高糖刺激的條件。Collison等[21]證明了中性粒細胞膜上存在AGEs受體，能與中性粒細胞結合并引起胞內Ca2+一過性升高。受此啟發，本研究使用AGEs干預中性粒細胞，但未得出AGEs明顯抑制中性粒細胞趨化功能的結論。

本課題組在先前的研究中發現細菌內毒素刺激中性粒細胞后，激發中性粒細胞自分泌ATP，順序活化ATP/P2X1/Ca2+信號通路，導致細胞骨架肌球蛋白輕鏈異常磷酸化及極性化，最終抑制中性粒細胞趨化功能[22]。在本研究中，高濃度棕櫚酸明顯抑制中性粒細胞的趨化功能，促進中性粒細胞表面P2X1受體表達升高，二者呈負相關。可見棕櫚酸在抑制中性粒細胞趨化功能方面表現出了類似內毒素的作用，同時又與患者存在的慢性炎癥互為因果。該結論提示，在2型糖尿病患者感染的防治工作中，血脂代謝異常的負面影響不容忽視。同時，中性粒細胞P2X1受體在延緩2型糖尿病患者疾病進程以及治療感染并發癥中或可作為重要靶點發揮作用，其對中性粒細胞趨化功能的調控，對改善2型糖尿病患者的慢性炎癥狀態具有巨大潛在應用前景。

多數臨床工作者對中性粒細胞的關注僅停留在計數上，用于輔助診斷炎癥感染狀態，而中性粒細胞最為重要的趨化、殺菌等功能往往被忽視。本研究結果表明，在2糖尿病患者感染相關的診療中，相較于感染發生后的抗感染治療，及早調節脂質代謝，可減輕脂質代謝異常對中性粒細胞造成的損害，增強患者抗感染能力。

綜上所述，2型糖尿病患者中性粒細胞趨化功能發生障礙，棕櫚酸通過中性粒細胞P2X1受體抑制中性粒細胞趨化功能。P2X1受體或可作為一種新的檢測指標和靶點，對于預警和治療2型糖尿病患者感染并發癥具有很好的臨床意義。