有氧間歇運動對2型糖尿病大鼠心肌線粒體自噬的影響*

侯改霞， 習雪峰， 劉倩倩， 付素煥， 唐書曼， 卞寒雪

有氧間歇運動對2型糖尿病大鼠心肌線粒體自噬的影響*

侯改霞， 習雪峰△， 劉倩倩， 付素煥， 唐書曼， 卞寒雪

（河南大學體育學院，河南 開封 475001）

探討線粒體自噬在運動（Exe）干預2型糖尿病心肌病中的作用及可能機制。自發性2型糖尿病Goto-Kakizaki （GK）大鼠隨機分為2組：糖尿病組（GK組）和GK+Exe組，每組8只；另增設8只同周齡雄性Wistar大鼠作為對照組（Wistar組）。GK+Exe組大鼠經有氧間歇運動干預8周，每天60 min，每周5 d。在最后一次運動結束48 h后，過夜禁食12 h后，將大鼠腹腔麻醉、剖腹，腹主動脈采血，檢測空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）及血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK）水平。制作心肌透射電子顯微鏡切片，觀察心肌細胞及線粒體的超微結構。Western blot法測定心肌組織中p-AMPK、p-ULK1、TFEB、PINK1、parkin、LC3-II、LC3-I和p62蛋白表達，并計算LC3-II/LC3-I比值。與Wistar組相比，GK組大鼠FBG及血清LDH和CK水平顯著升高（<0.01），FINS水平顯著降低（<0.01）；心肌線粒體結構欠缺，有空泡現象，偶見自噬體；心肌p-ULK1表達顯著下降（<0.01），p62表達顯著升高（<0.01）。與GK組相比，GK+Exe組大鼠FBG和血清CK水平顯著降低（<0.05），FINS水平顯著升高（<0.05）；心肌線粒體結構基本完整，空泡現象減輕，自噬體形成增多；心肌p-AMPK、p-ULK1、TFEB和parkin表達及LC3-II/LC3-I顯著升高（<0.05或<0.01），p62表達顯著下降（<0.05）。有氧間歇運動對2型糖尿病心肌病具有一定的緩解作用，其機制可能與激活心肌AMPK/ULK1信號通路，提高心肌線粒體自噬有關。

糖尿病心肌??；有氧間歇運動；線粒體自噬；AMPK/ULK1信號通路

2型糖尿病是一種以胰島素分泌和利用缺陷為特征的慢性代謝性疾病。糖尿病患者發生心力衰竭的風險（39%）是非糖尿病患者（23%）的近兩倍，心力衰竭是糖尿病患者死亡的主要原因［1］。線粒體對于心肌收縮、電穩定性、細胞存活和凋亡非常重要。在高血糖環境下，心肌細胞內受損/缺陷線粒體積累增多，心肌細胞代謝和功能異常［2］。線粒體自噬可選擇性的清除衰老或損傷的線粒體，維持心肌細胞線粒體的數量與形態平衡，達到抑制氧化應激、減少細胞損傷的作用。因此，線粒體自噬與糖尿病心肌病的發生、發展密切相關。

AMPK（AMP-activated protein kinase）及其下游調節因子ULK1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1）已被證明在線粒體自噬中發揮關鍵作用。運動是防治2型糖尿病及其并發癥的常用輔助療法之一。運動（exercise， Exe）可通過激活AMPK，提高運動后骨骼肌線粒體自噬水平；若抑制AMPK活性或敲除基因，運動則無法誘導骨骼肌細胞線粒體自噬的變化［3］。運動可有效誘導自噬的發生，一次急性運動可使心肌細胞內自噬相關蛋白的表達發生變化，運動對心肌的保護作用部分是通過運動增加自噬實現的［4］，但具體機制還有待于進一步研究。已有研究表明，運動對糖尿病心肌病確有一定的緩解作用［5-6］。但是，關于線粒體自噬在運動緩解糖尿病心肌病中作用和機制的研究還較少。因此，本研究將以AMPK/ULK1信號通路作為出發點，探討線粒體自噬在運動干預2型糖尿病心肌病中的作用及可能機制。

材料和方法

1　材料

18只自發性2型糖尿病Goto-Kakizaki （GK）大鼠（300～350 g）和8只Wistar大鼠（400～450 g）均購自斯貝福（北京）生物技術有限公司［16周齡，雄性，SPF級，許可證號為SCXK（京）2019-0010］。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）和肌酸激酶（creatine kinase， CK）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；胰島素ELISA試劑盒（聯科生物）；兔抗大鼠p-AMPK多克隆抗體（CST）；兔抗大鼠p-ULK1多克隆抗體和小鼠抗大鼠PINK多克隆抗體（Abcam）；兔抗大鼠parkin多克隆抗體和小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗體（Servicebio）；兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）多克隆抗體（武漢三鷹）；小鼠抗大鼠p62單克隆抗體（Santa）；兔抗大鼠轉錄因子EB（transcription factor EB， TFEB）多克隆抗體（BIOSS）；其他試劑均為國產分析純。

透射電子顯微鏡（HITACHI）；臺式高速冷凍型微量離心機（Dragon Lab）；酶標檢測儀（Rayto）；電泳儀（北京六一儀器廠）；圖像采集分析系統（Nikon）；血糖儀（日本京都）；動物跑臺（成都泰盟）。

2　方法

2.1實驗分組GK大鼠經過1周的適應性喂養后，檢測隨機血糖，并進行口服糖耐量實驗。GK大鼠隨機血糖≥11.1 mmol/L且口服糖耐量降低為2型糖尿病GK大鼠成模標準［7-8］，共篩選出16只GK大鼠用于后續實驗。將篩選出的GK大鼠隨機分為2組：糖尿病組（GK組）和GK+Exe組，每組8只。另設8只同周齡雄性Wistar大鼠作為對照組（Wistar組）。所有大鼠分籠飼養，自由飲水、攝食，室溫為（22±2） ℃，相對濕度為40%～60%，光照/黑暗周期為12 h（8：00～20：00）。

2.2運動干預［9］GK+Exe組大鼠采用有氧間歇跑臺運動（aerobic interval training， AIT）。正式運動前先進行1周的適應性運動。第2周開始進行正式AIT，每天60 min，每周5 d，共8周。正式運動時，首先進行10 min的熱身運動，然后在22 m/min、7 min和15 m/min、3 min之間交替進行共60 min的運動。

2.3實驗取材為了避免急性運動對實驗結果的影響，在最后一次跑臺運動結束48 h后，過夜禁食12 h，采用血糖儀檢測大鼠空腹血糖（fast blood glucose， FBG），將大鼠腹腔麻醉、剖腹，腹主動脈采血，全血3 000 r/min離心20 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測空腹胰島素（fasting insulin， FINS）、LDH和CK。取部分左心室置于2.5%戊二醛固定液，以備心肌透射電鏡切片的制作及觀察；另取部分左心室置于-80℃冰箱保存，用于測定心肌線粒體自噬相關蛋白的表達情況。

2.4血液指標的檢測FINS、LDH和CK的檢測完全按照試劑盒說明書進行。

2.5心肌透射電鏡制片及觀察（1）固定：取大鼠左心室1 mm×1 mm×1 mm大小的組織置于電鏡固定液進行固定。（2）后固定：1%鋨酸室溫固定2 h。（3）脫水：依次放入30%、50%、70%、80%、95%、100%和100%乙醇脫水，每次20 min，100%丙酮兩次，每次15 min。（4）滲透包埋：丙酮∶包埋劑=1∶1， 2～4 h， 丙酮∶包埋劑=1∶2，滲透過夜，純包埋劑，5～8 h，均在37 ℃條件下進行。（5）聚合：置于60 ℃烤箱聚合48 h。（6）超薄切片：60～80 nm超薄切片，150目銅網撈片。（7）染色：銅網置于醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min，枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min。（8）透射電鏡下觀察，采集圖像分析。

2.6Western blot檢測取100 μg心肌組織加入1 mL裂解液充分裂解，離心，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離，PVDF膜轉膜，5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育Ⅰ抗（1∶1 000）過夜，孵育Ⅱ抗（1∶5 000）30 min，化學發光法顯影、定影，掃描膠片存檔。以GAPDH為內參照。采用ImageJ軟件對實驗結果進行半定量分析。

3　統計學處理

采用SPSS 20.0軟件包進行統計分析。數據用均數±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　大鼠的一般體征

Wistar組大鼠體形正常，皮毛呈白色且有光澤，飲食、大小便正常，精神狀態良好，反應敏捷；GK組大鼠體型較瘦，毛色發黃，缺少光澤，反應遲鈍，出現多飲多尿癥狀；GK+Exe組大鼠體形、皮毛色澤、精神狀態、反應等情況均有一定程度的改善。

2　大鼠血液相關指標的比較

如表1所示，與Wistar組相比，GK組大鼠FBG、LDH和CK水平顯著升高（<0.01），FINS水平顯著降低（<0.01）；與GK組相比，GK+Exe組大鼠FBG和CK水平顯著降低（<0.05），FINS水平顯著升高（<0.05），但GK+Exe組大鼠FBG和LDH水平仍顯著高于Wistar組（<0.01），FINS水平顯著低于Wistar組（<0.01）。

表1　不同組別大鼠FBG、FINS、LDH和CK水平的比較

3　大鼠心肌超微結構的比較

如圖1所示，Wistar組大鼠心肌線粒體結構完整，無空泡、無腫脹變形，基質致密，線粒體嵴排列整齊、無斷裂；GK組大鼠部分線粒體結構欠缺，線粒體嵴部分斷裂，有空泡現象，基質密度降低，偶見自噬體；GK+Exe組大鼠線粒體結構基本完整，空泡現象減輕，線粒體基質致密，膜基本完整，自噬體形成增多。

Figure 1.Ultrastructure of myocardial mitochondria in the rats of different groups （×6 000， scale bar=1 μm）.

4　大鼠心肌p-AMPK和p-ULK1水平的變化

與Wistar組相比，GK組大鼠心肌p-ULK1水平顯著下降（<0.01）；與GK組相比，GK+Exe組p-AMPK和p-ULK1水平均顯著升高（<0.01），見圖2。

Figire 2.Comparison of expression of p-AMPK and p-ULK1 in myocardium of rats in different groups. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs Wistar group； ##P<0.01 vs GK group.

5　大鼠心肌TFEB表達的變化

與Wistar組相比，GK組大鼠心肌TFEB表達無顯著差異（>0.05）；與Wistar組和GK組相比，GK+Exe組TFEB表達顯著升高（<0.05或<0.01），見圖3。

Figure 3.Comparison of expression of TFEB in myocardium of rats in different groups. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs Wistar group； #P<0.05 vs GK group.

6　大鼠心肌PINK1和parkin表達的變化

與Wistar組相比，GK組大鼠心肌PINK1和parkin表達無顯著差異（>0.05）；與Wistar組相比，GK+Exe組大鼠心肌PINK1表達顯著升高（<0.05）；與Wistar組和GK組相比，GK+Exe組大鼠心肌parkin表達顯著升高（<0.01），見圖4。

Figure 4.Comparison of expression of PINK1 and parkin in myocardium of rats in different groups. Mean±SD. n=8. *P<0.05， **P<0. 01 vs Wistar group； ##P<0.01 vs GK group.

7　大鼠心肌LC3-II/LC3-I和p62表達的變化

與Wistar組相比，GK組和GK+Exe組大鼠心肌p62表達顯著升高（<0.05或<0.01）；與GK組相比，GK+Exe組大鼠心肌LC3-II/LC3-I顯著升高（<0.01），p62表達顯著下降（<0.05），見圖5。

Figure 5.Comparison of expression of p62 and LC3-II/LC3-I in myocardium of rats in different groups. Mean±SD. n=8. *P<0.05，**P<0.01 vs Wistar group； #P<0.05， ##P<0.01 vs GK group.

討論

線粒體是心肌細胞的“能量工廠”，其體積占據細胞質體積的35%～40%，為心臟跳動提供95%的ATP。在心肌細胞中，線粒體對于心肌收縮、電穩定性和細胞存活或凋亡非常重要，在生理條件和病理應激損傷中調節細胞的多種生理過程［10］。在糖尿病機體中，健康的線粒體對于心肌細胞存活至關重要。然而，在持續的高血糖刺激下，心肌細胞的線粒體斷裂、活性氧（reactive oxygen species， ROS）增多，線粒體膜電位和電子傳遞鏈活性降低，心肌細胞能量缺乏，心肌細胞凋亡，最終導致心功能不全。線粒體功能障礙可能是糖尿病心肌病的中心介質［11］。在本研究中，2型糖尿病GK大鼠FBG及血清CK和LDH水平顯著升高，FINS水平顯著降低，電鏡觀察結果顯示心肌線粒體損傷嚴重；而規律的有氧間歇運動降低了GK大鼠FBG和血清CK水平，升高了FINS水平，心肌細胞線粒體自噬體增多，線粒體損傷減輕。這提示2型糖尿病GK大鼠心肌細胞遭到了一定程度的損害，運動對其緩解作用除了與降低血糖、提高胰島素水平相關外，可能與增強心肌細胞線粒體自噬，降低線粒體的損傷相關。

線粒體自噬可選擇性降解受損或衰老的線粒體，并使其循環利用［12］。以往研究表明，在代謝綜合征心臟中，線粒體自噬要么下調［13］，要么上調［14］。線粒體自噬在糖尿病心肌病中的潛在機制尚未完全明確。Tong等［15］發現，在糖尿病心肌病早期發展過程中，線粒體自噬被激活，但不足以保護心臟。增強線粒體自噬功能可減輕線粒體功能障礙，減少脂質積聚，并防止心臟舒張功能障礙。通過藥物（如非諾貝特、二甲雙胍和白藜蘆醇等）干預激活自噬可挽救糖尿病引起的心臟功能障礙，而抑制自噬會加劇糖尿病心肌病。

AMPK和ULK1已被證明在線粒體自噬中發揮關鍵作用［16］。線粒體受損時，線粒體中AMPK表達量約增加3倍，表明AMPK被招募到線粒體以應對線粒體損傷。AMPK可與ULK1富含絲氨酸/脯氨酸的區域相互作用，并直接磷酸化ULK1的多個位點，導致ULK1構象變化，從而促進ULK1與其復合物其他組分的相互作用，增加ULK1活性和穩定性。在基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞，ULK1不能被激活，自噬被抑制，受損線粒體積聚，證明AMPK誘導的ULK1磷酸化在自噬中十分重要［17］。本研究發現，2型糖尿病GK大鼠心肌p-ULK1水平下降，而運動可提高GK大鼠心肌p-AMPK和p-ULK1水平，提示運動可能通過提高GK大鼠心肌p-AMPK和p-ULK1的水平，開啟增強心肌線粒體自噬的通路。前人關于運動與骨骼肌線粒體自噬的研究也證實了這一點。急性運動可刺激AMPK和ULK1磷酸化［18］，AMPK是運動誘導ULK1特異性磷酸化參與下游線粒體自噬途徑所必需的。同樣，骨骼肌基因缺失也會抑制線粒體自噬［3］，而且ULK1在將溶酶體靶向受損/功能失調的線粒體方面具有重要作用。

TFEB是自噬的主要轉錄調節因子，可協調約60種溶酶體水解酶以及溶酶體和自噬體膜相關輔助蛋白的表達，同時也調節自噬囊泡的形成、定位和通量［19］，激活整個自噬溶酶體途徑。本研究發現，運動提高了GK大鼠心肌TFEB表達，這可能與運動提高了GK大鼠心肌p-AMPK水平有關。激活AMPK可通過多種途徑調節TFEB表達［20］。TFEB可上調內皮細胞的自噬相關基因的表達，通過促進血管生成，改善心肌梗死后心臟功能的恢復［21］，TFEB的下調會導致心肌自噬通量受損、氧化應激增加［22］。

在線粒體自噬過程中，PINK1/parkin信號通路的主要功能為監控線粒體質量，識別受損線粒體，標記受損線粒體，募集自噬受體，開啟自噬過程。本研究結果表明，間歇性有氧運動可增強2型糖尿病大鼠心肌PINK1和parkin表達，與提高p-AMPK、p-ULK1和TFEB水平的作用一致，可能在增強糖尿病心肌線粒體自噬方面起到相輔相成的作用?，F在研究認為，AMPK和（或）ULK1的一些下游靶點可能參與PINK1/parkin信號通路。而parkin中ULK1磷酸化位點突變、遺傳性或基因缺失或藥理學ULK1抑制，都會延遲parkin的激活，導致parkin和線粒體自噬功能的缺陷［16］。同樣，TFEB與PINK1/parkin誘導的線粒體自噬也有關系。PINK1/parkin與線粒體結合依賴于TFEB［23］。反過來，PINK1/parkin也可促進TFEB向細胞核的移位，激活溶酶體基因的表達，增強線粒體自噬［24］。

磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine， PE）是自噬小體的一種整合蛋白，Atg8家族蛋白與PE的結合是吞噬囊泡形成的一個關鍵因素。LC3是Atg8蛋白中的亞家族，通常以LC3-I的形式存在于細胞質中。當線粒體自噬發生時，LC3-I通過類泛素樣修飾的方式與PE共價結合，形成LC3-II。此后，LC3-II促進自噬泡雙層膜的起始、延伸及閉合，提供自噬受體的結合位點，并與溶酶體膜融合。LC3-II與自噬小體數量緊密相關，是反映線粒體自噬活性的關鍵指標。p62通過其LIR（LC3-interaction region）結構域與LC3形成復合物，被包裹進自噬小體，可作為自噬特異性底物在自噬溶酶體內降解［25］。自噬發生時，p62被不斷降解；當自噬功能受損或減弱時，p62蛋白明顯累積。因此，p62蛋白表達水平與自噬活性成反比，是檢測線粒體自噬的一個輔助指標。本研究結果表明，間歇性有氧運動可提高2型糖尿病大鼠心肌LC3-II/LC3-I水平和p62蛋白表達，從而促進心肌線粒體自噬。研究發現，活化的AMPK可以調節ULK1磷酸化，進而磷酸化FUN14結構域包含蛋白1（FUN14 domain containing 1， FUNDC1）的Ser17位點，提髙FUNDC1與LC3的結合效率，促進線粒體自噬［26］。此外，磷酸化ULK1還可通過對p62的UBA結構域Ser403位點的磷酸化作用，導致p62泛素化，激活線粒體自噬［27］。

總之，鑒于上述的AMPK/ULK1與TFEB、PINK1/parkin、LC3和p62在線粒體自噬中的密切關系，結合本文的研究結果，提示間歇性有氧運動可能通過增強2型糖尿病大鼠心肌AMPK/ULK1信號通路的作用，提高了心肌線粒體自噬，從而緩解2型糖尿病心肌病。然而，具體機制仍有待進一步研究。

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Effects of aerobic interval training on autophagy of myocardial mitochondria in type 2 diabetic rats

HOU Gai-xia， XI Xue-feng△， LIU Qian-qian， FU Su-huan， TANG Shu-man， BIAN Han-xue

（，，475001，）

To investigate the effect of exercise （Exe） intervention on type 2 diabetic cardiomyopathy and its possible mechanism.Spontaneously type 2 diabetic Goto-Kakizaki （GK） rats were randomly divided into diabetic group （GK group） and GK+Exe group， while another 8 male Wistar rats served as control group （Wistar group）. The rats in GK+Exe group were treated with aerobic interval training， 60 min per day， 5 d per week for 8 weeks. The rats were anesthetized， and the blood was collected 48 h after the last Exe with overnight fasting. Fasting blood glucose （FBG）， fasting inslulin （FINS）， and serum LDH and CK levels were measured. Ultrastructure of cardiomyocytes and mitochondria was observed by transmission electron microscopy. The protein levels of p-AMPK， p-ULK1， TFEB， PINK1， parkin， LC3-II， LC3-I and p62 in myocardial tissues were measured by Western blot， and the ratio of LC3-II/LC3-I was calculated.Compared with Wistar group， the FBG， and serum LDH and CK levels were increased in GK group （0.01）， and FINS in GK group was decreased significantly （<0.01）. Incomplete mitochondrial structure， vacuole and occasional autophagy were observed in the myocardial mitochondria of GK rats. The expression of p-ULK1 was decreased， while p62 was increased in GK group （0.01）. Compared with GK group， the FBG and serum CK levels were decreased， while FINS was increased significantly in GK+Exe group （0.05）. Normal mitochondrial structure， less vacuoles and more autophagosomes were observed in GK+Exe group. Exe also elevated the levels of p-AMPK， p-ULK1， TFEB， parkin and LC3-II/LC3-I， but inhibited p62 expression （0.05）.Aerobic interval training attenuates type 2 diabetic cardiomyopathy through AMPK/ULK1 signaling pathway and myocardial mitochondrial autophagy.

Diabetic cardiomyopathy； Aerobic interval training； Mitophagy； AMPK/ULK1 signaling pathway

R587.2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.008

**0.01Wistar group；△<0.05GK group.

1000-4718（2022）03-0442-06

2021-12-01

2022-01-20

［基金項目］河南省重點研發與推廣專項（科技攻關）項目（No. 202102310318； No. 212102310262）；河南省高等學校重點科研項目（No. 20A890002）

Tel： 0378-22866474； E-mail： 271070602@qq.com

（責任編輯：盧萍，羅森）