基于炎癥、細胞凋亡、血小板聚集、蛋白質合成過程的追風傘抑制骨關節炎大鼠滑膜損傷的研究＊

李煦照，李紅美，張帥男

（貴州中醫藥大學藥學院 貴陽 550025）

骨關節炎是一種慢性退行性關節疾病。其全球發病率為2%-6%，70歲以上的人群發病率超過40%[1]。關節滑膜損傷是骨關節炎的重要病理特征之一，涉及了多種病理機制，如炎癥、血小板的聚集、細胞凋亡、生長因子失調，蛋白質合成功能障礙等[1-3]。滑膜炎癥影響了骨關節炎的癥狀和發病進程[4]。此外，血小板聚集是該疾病滑膜中的重要炎癥標志物[5]。多種生長因子從血小板中釋放出來，并參與了病變組織的修復和再生[3]。在骨關節炎中，細胞凋亡和蛋白質的合成過程也參與了滑膜組織的修復和再生[3,6]。

追風傘是報春花科植物狹葉落地梅Lysimachia paridiformisFranch. var.stenophyllaFranch 的干燥全草，具有祛風通絡、活血止痛的功效，可以用于風濕痹痛、四肢拘攣、半身不遂等[7]。前期生物標簽研究表明[2-3]，追風傘影響了關節滑膜中一些與炎癥、細胞凋亡、血小板聚集和蛋白質合成過程相關的內源性靶點的表達。這些靶點參與了骨關節炎的發病機制[2-3]。因此，我們推測，追風傘可以通過調節這些病理過程來減輕骨關節炎的滑膜損傷。

1 材料和方法

1.1 追風傘提取物的制備

追風傘提取物的制備方法已在本課題組的前期研究中進行描述[3]。追風傘飲片粉碎后使用10倍量的蒸餾水進行回流提取，總共提取3次，每次2 h，合并提取液，進行凍干，得到凍干粉，得率為12.65%。

1.2 試劑

碘乙酸鈉（I2512，美國Sigma-Aldrich公司）；雙氯芬酸鈉（D6899，美國Sigma-Aldrich公司）；前列腺素E1（PGE1）酶聯免疫吸附分析試劑盒（E-EL-0052c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；花生四烯酸（AA）酶聯免疫吸附分析試劑盒（E-EL-0051c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；整合素α2b抗體（Itga2b，PB9647，武漢博士德生物工程有限公司）；整合素β抗體（Itgb3，BM4120，武漢博士德生物工程有限公司）；血管內皮生長因子A抗體（VEGFA，BA0407，武漢博士德生物工程有限公司）；胰島素樣生長因子1抗體（IGF 1，BA0939，武漢博士德生物工程有限公司）；成纖維細胞生長因子2抗體（FGF-2，PB0619，武漢博士德生物工程有限公司）；肝細胞生長因子抗體（HGF，BA0911，武漢博士德生物工程有限公司）；腫瘤壞死因子α抗體（TNF-α，PB0082，武漢博士德生物工程有限公司）；血小板衍生生長因子A抗體（PDGF-A，bs-0196R，北京博奧森生物技術有限公司）；轉化生長因子β1抗體（TGFβ1，bs-0086R，北京博奧森生物技術有限公司）；延伸因子1-α2抗體（eEF1A2，bs-13054R，北京博奧森生物技術有限公司）；翻譯起始因子2B亞基β抗體（EIF2B2，bs-14536R，北京博奧森生物技術有限公司）；真核翻譯起始因子4B抗體（EIF4B，bs-4103R，北京博奧森生物技術有限公司）；絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa調節亞基抗體（PPP2R5C，bs-11991R，北京博奧森生物技術有限公司）；脆性X智力低下綜合征相關蛋白1抗體（FXR1，bs-5528R，北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 儀器

數字游標卡尺（德國Preisser公司）；RM2235石蠟切片機（德國LEICA公司）；DM3000顯微鏡（德國LEICA公司）。

1.4 動物與分組

60只雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級，體質量250 ± 20 g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所，許可證號：SCXK（津）2014-0002。大鼠飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所，12 h光照、12 h避光循環飼養，室內溫度為（22 ± 1）℃，相對濕度40%-50%，飼喂標準飼料和飲用水。

將大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥治療組、追風傘低劑量組、追風傘中劑量組、追風傘高劑量組，每組10只。模型組、陽性藥治療組和追風傘治療組麻醉后，使用26G針頭將50 μL的碘乙酸鈉（3 mg）生理鹽水溶液通過髕韌帶注入膝關節中[3]。空白組注射0.9%無菌生理鹽水。造模24 h后，追風傘低劑量組、追風傘中劑量組、追風傘高劑量組分別灌胃給予相當于人生藥量0.143、0.288、0.428 g·kg-1的追風傘提物，每天1次，連續30天。陽性藥治療組給予10 mg·kg-1的雙氯芬酸鈉，每天1次，連續30天。空白組和模型組給予等量生理鹽水，每天1次，連續30天。

1.5 關節腫脹度分析和樣本收集

最后一次給藥24 h后，用數字游標卡尺測量大鼠關節的直徑。隨后，收集各組大鼠關節滑膜組織樣本，用于組織病理學、免疫組化、酶聯免疫吸附分析和Western blot分析。

1.6 組織病理學和免疫組學分析

將關節滑膜組織樣本置于4%的多聚甲醛中固定過夜，隨后包埋在石蠟中，用石蠟切片機切成5 mm的石蠟切片。一部分組織切片使用蘇木精和伊紅染色進行組織病理學分析；另一部分組織切片根據Elivsion二步法進行免疫組化染色，用于分析Itga2b（抗體稀釋比例1∶100）、Itgb3（抗體稀釋比例1∶100）、eEF1A2（抗體稀釋比例1∶400）、EIF2B2（抗體稀釋比例1∶400）和EIF4B（抗體稀釋比例1∶400）的表達。在200倍顯微鏡視野下進行圖像采集，隨后運用Image Pro Plus軟件（6.0版本，美國Media Control Netics公司）來計算靶蛋白的積分光密度（IOD）。

1.7 酶聯免疫吸附分析

將關節滑膜組織樣本置于冰冷的PBS中進行勻漿，將勻漿液在4℃下，2500 r·min-1離心10 min，取出上清液置于離心管中。隨后根據說明書操作，使用酶聯免疫吸附試劑盒分析組織勻漿中的AA和PGE1的水平。

1.8 Western blot分析

運用Western blot分析關節滑膜組織中的PDGFA（抗體稀釋比例1∶500）、VEGFA（抗體稀釋比例1∶500）、IGF 1（抗體稀釋比例1∶200）、FGF-2（抗體稀釋比例 1∶100）、HGF（抗體稀釋比例1∶300）、TGFβ1（抗體稀釋比例1∶500）、PPP2R5C（抗體稀釋比例1∶600）、FXR1（抗體稀釋比例1∶500）和TNF-α（抗體稀釋比例1∶500）的表達量，步驟已在本課題組的前期研究中進行描述[3]。

圖1 關節腫脹度分析（A）及AA（B）和PGE1（C）的酶聯免疫吸附分析（n=10）

圖2 大鼠關節滑膜的組織病理學分析（n=10，200×）。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 關節腫脹度分析

與空白組相比（如圖1A），模型組大鼠關節直徑顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，陽性藥治療組和追風傘治療組的大鼠關節直徑顯著減小（P＜0.05）。中、高劑量組之間存在顯著性差異。

圖3 大鼠關節滑膜組織中Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平（n=10，200×）

2.2 關節滑膜組織中的AA和PGE1的水平

與空白組相比（如圖1B和C），模型組關節滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別增加了55%和減少了41.7%。與模型組相比，陽性藥治療組關節滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了53.0%和增加了92.4%，追風傘低劑量組關節滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了12.8%和增加了25.2%，追風傘中劑量組關節滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了27.7%和增加了49.0%，追風傘高劑量組關節滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了22.5% 和增加了71.9%。對于AA，各治療組之間無顯著性差異；對于PGE1，低、高劑量組之間存在顯著性差異。

圖4 大鼠關節滑膜中PDGF-A（A）、VEGFA（B）、IGF 1（C）、FGF-2（D）、HGF（E）、TGFβ1（F）、PPP2R5C（G）、FXR1（H）和TNF-α（I）的表達水平（n=10）

2.3 大鼠滑膜組織的病理學分析

組織病理學分析（如圖2）表明，在空白組的關節滑膜組織中，細胞單層排列且未發現異常的炎性細胞。模型組的大鼠關節滑膜組織中發生了嚴重的炎癥反應，滑膜明顯增生，細胞排列不規則，炎性細胞浸潤。陽性藥治療組和追風傘治療組的滑膜損傷較輕，滑膜增生被抑制，炎癥反應被逆轉。

2.4 大鼠關節滑膜組織中 Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平

與空白組相比（如圖3），模型組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平分別增加了2913.0%、154992.0%、11280.0%、380.5% 和 213499.5%。與模型組相比，陽性藥治療組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平分別減少了97.7%、95.1%、99.6%、78.9%和67.4%，追風傘低劑量組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平分別減少了58.3%、29.0%、96.9%、22.0%和20.2%，追風傘中劑量組中的 Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平分別減少了79.5%、56.1%、96.6%、53.5%和91.7%，追風傘高劑量組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平分別減少了98.7%、79.5%、77.1%、98.4%和98.6%。對于Itga2b、Itgb3及EIF4B，各治療組之間有顯著性差異；對于eEF1A2和EIF2B2，高劑量組分別與低中劑量組之間存在顯著性差異。

2.5 大鼠關節滑膜中PDGF-A、VEGFA、IGF 1、FGF-2、HGF、TGFβ1、PPP2R5C、FXR1和 TNF-α 的表達水平

與空白組相比（如圖4），模型組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達水平分別增加了197.1%、170.7%、208.7%和151.0%，模型組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達水平分別減少了83.2%、60.6%、65.3%、61.4%和69.0%。與模型組相比，陽性藥治療組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達水平分別減少了53.0%、58.5%、60.7%和54.1%，陽性藥治療組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達水平分別增加了379.4%、130.8%、139.4%、103.5%和129.9%，追風傘低劑量組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達水平分別減少了24.3%、10.8%、16.2%和20.3%，追風傘低劑量組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達水平分別增加了135.8%、34.0%、42.9%、2.8%和46.3%，追風傘中劑量組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達水平分別減少了38.3%、21.5%、29.1%和31.4%，追風傘中劑量組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達水平分別增加了241.1%、77.6%、76.1%、45.3%和66.2%，追風傘高劑量組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達水平分別減少了46.4%、50.8%、50.1%和47.9%，追風傘高劑量組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達水平分別增加了348.2%、100.2%、138.2%、88.9% 和 124.3%。對于 PDGF-A、VEGFA、HGF、TGFβ1、PPP2R5C、FXR1和 TNF-α，低、高劑量組之間存在顯著性差異；對于IGF 1，高劑量組分別與低中劑量組之間存在顯著性差異；對于FGF-2，各治療組之間無顯著性差異。

3 討論

關節內注射碘乙酸鈉是一種常用的骨關節炎模型的造模方式[8]。實驗結果表明，碘乙酸鈉可以對關節滑膜造成嚴重損傷。前期研究已經表明，碘乙酸鈉能誘導關節滑膜中的炎癥、細胞凋亡和血小板聚集[3,9-10]。

3.1 追風傘抑制骨關節炎中的滑膜炎癥

骨關節炎是一種發生在滑膜關節的炎癥疾病。碘乙酸鈉促進炎癥細胞浸潤到關節滑膜中，并誘導炎癥反應，從而進一步導致滑膜增生和關節腫脹。追風傘可以減輕炎癥細胞在滑膜中的浸潤，從而減輕隨后由炎癥反應誘導的滑膜和關節病變。此外，前期生物標簽研究也表明了，AA是追風傘在滑膜細胞中的敏感靶點[2]。AA的異常表達能引起滑膜炎癥，并易于誘發骨關節炎[11]。追風傘治療組具有能抑制滑膜中AA表達的趨勢。

3.2 追風傘調節骨關節炎滑膜細胞凋亡

細胞凋亡在骨關節炎的發病機制中起到關鍵的作用[1]。前期的研究發現[3]，FXR1和TNF-α的異常表達參與了碘乙酸鈉誘導的細胞凋亡的過程。然而，在模型組中，PPP2R5C（一種抗凋亡蛋白）也發生高表達，這可能是滑膜細胞抵抗碘乙酸鈉誘導的細胞凋亡的自我保護機制。追風傘可以逆轉這些蛋白質的異常表達，這有助于骨關節炎滑膜中的抗凋亡和促凋亡過程恢復平衡。

3.3 追風傘抑制骨關節炎滑膜中血小板的聚集

骨關節炎滑膜中血小板的數量增加及激活是炎癥反應的標志物[5]。激活的血小板能誘導滑膜微循環血栓的形成及軟骨損傷[12]。前期研究表明，追風傘干預的關節滑膜中的4個生物標簽與血小板聚集過程有緊密聯系[2-3]。Itga2b和Itgb3主要在血小板中表達，它們的表達水平可以代表血小板的數量[3]。與此同時，這兩個蛋白質的過表達也可以促進血小板聚集[3]，這與前期研究的結果是相一致的[3]。前期研究也表明了，追風傘可以增加滑膜中PGE1的表達水平，這有助于抑制碘乙酸鈉誘導的血小板聚集[2]。在本研究中，追風傘可以逆轉上述由碘乙酸鈉誘導的生物標簽的異常表達。此外，AA也可以誘導血小板聚集[13]。追風傘對AA表達的抑制也有助于減輕碘乙酸鈉誘導的血小板聚集。

血小板會釋放一些生長因子，它們在骨關節炎的發病過程中表達異常[14]。在本研究中，碘乙酸鈉在誘導滑膜中血小板聚集的同時，也影響了其中6種生長因子的表達。骨關節炎中PDGF-A和IGF1的表達上調在促進滑膜增生和增強滑膜細胞對炎癥介質的反應中發揮作用[15-16]。前期研究表明，HGF和VEGFA的表達呈正相關性，且兩者都是重要的血管生成因子[17]。血管生成是創傷愈合過程中的關鍵步驟[18]。因此，模型組中HGF和VEGFA的表達不足不利于滑膜損傷的修復。滑膜細胞中的；TGFβ1和FGF-2具有軟骨保護作用[19-20]，它們能促進軟骨的修復。模型組中的；TGFβ1和FGF-2的表達不足不利于骨關節炎軟骨損傷的修復。追風傘能逆轉由碘乙酸鈉誘導的生長因子的失調，這有助于骨關節炎中滑膜和軟骨損傷的修復。

3.4 追風傘調節骨關節炎滑膜中的蛋白質合成功能障礙

前期生物標簽研究結果顯示，eEF1A2、EIF2B2和EIF4B是追風傘干預關節滑膜的敏感靶點[3]。EIF2B2和EIF4B是蛋白質合成過程中的翻譯起始因子，eEF1A2是翻譯延伸因子[3]。有研究表明，eEF1A2和EIF4B的異常表達參與了骨關節炎的發病機制[21-22]。在骨關節炎的滑膜和軟骨中，蛋白質合成異常[23-24]。本研究表明，碘乙酸鈉可以引起滑膜中上述蛋白質的表達失調，因此，碘乙酸鈉也可以用于骨關節炎中滑膜的蛋白質合成功能障礙的機制和治療的研究。

在本研究中，碘乙酸鈉上調了eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達水平，這有利于蛋白質的合成。可能是由于碘乙酸鈉誘導關節滑膜損傷后，滑膜細胞產生的自我保護機制，從而增加蛋白質合成過程的效率，促進細胞和組織的修復和重建[3]。以上內容提示了，追風傘可通過多種途徑來減輕碘乙酸鈉誘導的滑膜損傷，進一步減少滑膜組織的自我修復和自我重建的需求，因此緩解了蛋白質的過度合成。追風傘抑制了這些蛋白質的表達。

4 結論

本研究表明，追風傘可以減輕碘乙酸鈉誘導的骨關節炎模型的關節腫脹和滑膜損傷。其機制可能涉及炎癥、細胞凋亡、血小板聚集和蛋白質合成功能障礙，這為后續追風傘治療骨關節炎的物質基礎的研究奠定基礎，為其在骨關節炎的臨床應用提供了重要的依據。