甘草附子湯治療類風濕性關節炎的網絡藥理學分析＊

張冬雪，曲 帥，董 凱，徐 晨，闞 鴻＊＊

（1.吉林農業大學中藥材學院 長春 130118；2.吉林省生物研究所藥用真菌研究室 長春 130012）

類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種受多種內源性和外源性因素影響的自身免疫性疾病，表現為關節發炎、劇痛、僵硬、疲勞、畸形和身體損傷[1]，常引起免疫功能紊亂或低下[2]，其特點是軟骨和骨質的破壞[3]。根據世界衛生組織數據，我國RA發病率約為0.4%，患者數量隨年齡增長呈上升趨勢[4]。當合并其他疾病時，患者的死亡率較高[5]。目前RA治療主要通過控制炎癥反應和減輕關節疼痛，西醫治療通常選取甾體抗炎藥、非甾體抗炎藥、免疫抑制藥等。然而，化學藥物易引發不良反應，特別是嚴重毒性，如肝、腎、胃腸道和惡性感染等[6]。因此中藥復方在類風濕關節炎治療中的應用呈上升趨勢，RA患者更傾向于選擇其作為補充藥物進行治療[7]。

中醫認為寒冷、潮濕、勞累等為RA的相關致病因素，將RA歸屬于“歷節病”的范疇，屬痹癥。甘草附子湯出自《傷寒論》，由甘草、附子、白術、桂枝四味藥材組成，為表里陽虛、風濕在表的配方。方中君藥附子溫經散寒、祛除筋骨之風濕；佐藥桂枝散寒解表祛濕、發汗消腫，強化附子的解濕邪作用；白術健脾去濕，兼走表里，增強附子和桂枝的功效。使藥炙甘草溫和、補中緩急，配以祛風除濕、強筋健骨之藥，使藥力更佳。臨床使用歷史悠久。曹江山[8]在研究關節炎中發現，運用甘草附子湯治療RA效果良好，尤其是對風寒痹阻型RA患者，可提高患者關節活動能力，降低實驗室炎癥指標。任慧[9]通過選用加味甘草附子湯對57例類風濕關節炎寒濕痹阻證的患者進行治療，發現加味甘草附子湯可有效緩解RA患者的癥狀體征，減少關節疼痛、關節壓痛、關節腫脹個數，從而減輕患者痛苦，且臨床安全性良好。馮亞兵[10]應用甘草附子湯治療RA，結果顯示總有效率達76.2%，明顯高于西藥對照組，且能夠顯著降低類風濕因子水平。而辨證論治的加減藥味變化導致中藥復方組合方式多樣，藥味含有大量復合化合物過于繁雜，無法僅通過常規實驗方法檢測，整體物質基礎及多重作用機制難以闡明[11-12]。

中藥網絡藥理學利用網絡大數據的分析可以廣泛應用于探索藥物和中藥的活性成分，解釋整體作用機制，分析藥對和組方的配伍規律[13-14]，為中醫藥從經驗醫學系統轉化為循證醫學系統提供了一種新的研究范式[15]。因此本研究采用網絡藥理學方法首先采用TCMSP、BATMAN-TCM和ETCM數據庫篩選了甘草附子湯的有效成分；隨后分析總結了活性成分的靶點；再利用藥物-疾病靶點、基因本體（GO）和生物途徑（KEGG）功能富集；最后，通過動物實驗對關鍵靶點加以驗證。為探討甘草附子湯治療RA的物質基礎及作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 甘草附子湯中化學成分檢索

借助TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）以“甘草”、“附子”、“白術”、“桂枝”為關鍵詞檢索甘草附子湯的化學成分。在TCMSP數據庫中依據藥代動力學ADME原則，以口服生物利用度（OB ≥3 0%），類藥性指數（DL ≥ 0.18）為條件對其活性成分進行篩選。BATMAN-TCM數據庫（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/）按照Score cutoff ≥ 20檢索四味藥成分及相關靶點，ETCM數據庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中截取QED得分＞0.67，對活性成分及其靶點進行補充，保證預測全面性，并通過文獻驗證數據庫檢索化學成分的準確性。

1.1.2 活性成分靶點篩選和“藥物-成分-靶點”網絡構建

基于Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/），查找1.1.1中篩選出活性成分對應的靶點及其相應的基因名，刪除重復靶點、無對應基因名的蛋白。用Cytoscape3.7.2軟件可視化分析藥物、成分、靶點之間的交互作用。

1.1.3 RA治療靶點預測

以“Rheumatoid arthritis”為關鍵詞搜索人類基因注釋的一站式搜索平臺Gene cards 數據庫（https://www.genecards.org/)、OMIM 數據庫（https://omim.org/）、Drugbank數據庫（https://go.drugbank.com/），查找疾病相關基因，利用多個公認疾病數據庫保證收集靶點的全面和準確。將甘草附子湯活性成分的靶點與RA的靶點進行映射分析，得到潛在作用靶點。

1.1.4 構建蛋白互作網絡（Protein-protein interaction，PPI）

將1.1.3中得到的甘草附子湯治療RA的靶點導入String數據庫（https://www.string-db.org/），選擇研究物種為人類，將獲取蛋白互作關系的結果以TSV格式導出，再導入Cytoscape3.7.2中進行網絡拓撲屬性分析，篩選核心靶點。

1.1.5 關鍵靶點的GO和KEGG分析

本研究通過Meta scape數據庫（https://metascape.org/），利用注釋基因和分析基因生物學過程的主要生物信息學工具GO，以及從高通量實驗技術產生的大規模分子數據集KEGG進行富集分析。運用微生信等平臺對數據進行氣泡圖可視化處理。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗材料與儀器

炙甘草、桂枝、白術、附子購于藥店；大鼠腫瘤壞死因子-α酶聯免疫試劑盒（TNF-α）、白細胞介素-6酶聯免疫試劑盒（IL-6）購于南京建成生物工程研究所；大鼠AKT-1蛋白酶聯免疫試劑盒（Akt-1）購于上海江萊生物科技有限公司。

Wistar大鼠，雄性30只，體質量（180±20）g，購于長春生物制品研究所有限責任公司（SCXK（吉）-2017-0005），實驗前適應環境飼養7天。

冷凍離心機（Eppendorf，美國）；酶標儀（Tecan，澳大利亞）；足趾容積測量儀（PV-200，成都泰盟軟件有限公司）。

1.2.2 甘草附子湯供試品的制備

以處方比例稱取炙甘草、附子、白術、桂枝四種藥材，參照文獻方法[16]制備甘草附子湯供試品溶液，冷凍干燥后低溫儲存備用。

1.2.3 甘草附子湯對大鼠佐劑型關節炎的影響

（1）踝關節組織學檢查

取大鼠的右后足踝關節，固定于福爾馬林溶液中，脫鈣處理后，按照文獻方法[17]進行HE染色，分別從炎癥細胞浸潤、滑膜增生、軟骨破壞和骨侵蝕程度對各組佐劑性關節炎大鼠的關節切片進行評分，評價標準為：無癥狀得0分，輕度癥狀得1分，中度癥狀得2分，重度癥狀得3分，總得分為12分[18]。

（2）甘草附子湯對AIA大鼠作用靶點的驗證

將30只大鼠隨機分為空白組（HG）、模型組（AIAG）、給藥組（GFDG），模型組和給藥組在大鼠左后足足趾處皮內注射0.1 mL含10 mg·mL-1滅活的結合分枝桿菌的完全弗氏佐劑，空白組在相同部位注射等量的生理鹽水，共注射2周，建立佐劑型關節炎模型。模型建立后，給藥組連續灌胃給藥甘草附子湯（給藥劑量按照臨床計量折算，6.5 g生藥·kg體質量-1），空白組和模型組給予等量的生理鹽水。連續給藥3周后，處死取血，4℃下離心3000 r·min-110 min獲得血清，保存于-80℃待用。將大鼠的踝關節組織去掉皮肉，用勻漿器與生理鹽水以1∶10的比例在冰浴中研磨，再將組織研磨液以3000 r·min-1低溫離心，得到上清液作為關節組織勻漿液，保存于-80℃待用。

分別按照試劑盒的方法檢測大鼠血清中的TNF-α、IL-6及踝關節組織中的 TNF-α、IL-6、Akt-1的表達。

1.2.4 統計學分析

統計分析采用SPSS 23軟件進行分析，所有數據均采用均值±標準差（），組間比較用單因素方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 甘草附子湯中活性化合物的篩選

從TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM數據庫檢索可得到甘草附子湯中活性物質共623種。活性成分篩選以OB＞30%，DL＞0.18或Score cutoff ≥20或QED得分＞0.67為標準，共篩選出136種，其中甘草101種，白術7種，附子21種，桂枝7種。甘草附子湯中部分有效成分的相關信息如表1所示。

2.2 “藥物-化合物-靶點”網絡構建與分析

采用Cytoscape3.7.2軟件對甘草附子湯中各藥味的成分、靶點進行網絡拓撲學分析，得到的“藥物-化合物-靶點”網絡圖，如圖1所示。

2.3 甘草附子湯-RA交集靶點

將篩選后的甘草附子湯有效活性成分靶點與RA的潛在靶點取交集，運用Venny繪圖，得到交集靶點127個，見圖2。

表1 甘草附子湯中部分有效成分的基本信息

圖1 草附子湯治療RA“藥物-化合物-靶點”網絡圖

圖2 甘草附子湯成分靶點與RA相關靶點關系的Venn圖

2.4 PPI網絡構建與分析

將甘草附子湯治療RA的127個潛在靶點基因輸入到STRING平臺中，進行PPI分析，通過Cytoscape對數據進行網絡拓撲分析，網絡中共包含127個節點，2607條邊，平均度值44.1。顏色的深淺隨度值增加而增加，度值越大與其他蛋白聯系越密切，作為潛在治療靶標的可能性越大（見圖3），主要蛋白資料見表2。

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

通過Metascape數據庫，對甘草附子湯治療RA的作用靶點進行富集分析，以P＜0.01為條件。GO分析結果顯示：檢索出748項與分子功能（Molecular，MF）相關，可體現在熱休克蛋白結合、抗氧化活性等功能上；參與生物過程（Biological process，BP）的4849項，包括對生長因子、創傷的反應、RNA聚合酶Ⅱpri-miRNA轉錄的調控等主要過程；得到440個細胞組分（Cellular components，CC）條目，主要以神經元、髓鞘、滑面內質網為主。對MF、BP、CC中P值排名前5的條目進行可視化分析（圖4）。KEGG分析得到247項，涉及癌癥的途徑、脂質與動脈粥樣硬化、NF-κB信號通路等。將KEGG分析得到的前20條通路進行可視化處理，結果如圖5所示。部分蛋白靶點與信號通路之間的聯系如表3所示，進一步建立“靶點-通路”網絡（圖6）。

圖3 甘草附子湯治療RA的關鍵節點篩選圖

表2 甘草附子湯治療RA中的重要靶點

2.6 甘草附子湯對RA損傷模型的保護作用

2.6.1 各組大鼠右后足關節的組織病理學分析

如圖7所示，HG大鼠右后關節切片無炎癥特征（圖7A），而AIA模型組大鼠出現嚴重的骨破壞、軟骨侵蝕、滑膜增生和炎癥浸潤（圖7B）。與AIA模型組相比，甘草附子湯組切片中組織水腫或滑膜肥大得到明顯緩解，炎癥細胞浸潤情況也有所減輕（圖7C）。AIA模型組和甘草附子湯組的病理學得分圖如圖7D所示，甘草附子湯組對AIA大鼠表現出明顯的治療作用。

2.6.2 甘草附子湯對AIA大鼠的影響

圖8顯示了各組大鼠足腫脹率，空白組大鼠的足腫脹率由于大鼠飼養5周體質量增加而略有增加，模型組的足腫脹率較高，達到了44.93±2.09%，給藥組在甘草附子湯治療3周后，與AIA模型組大鼠相比，大鼠足腫脹率顯著降低（P＜0.01）。結果表明，甘草附子湯可使大鼠足腫脹得到緩解。模型組大鼠的血清中TNF-α和IL-6水平顯著升高，表明了炎癥的發生。經甘草附子湯治療3周后，給藥組血清中TNF-α和IL-6的濃度較炎癥組明顯降低（圖9）。通過網絡藥理學預測可知，Akt-1、TNF-α和IL-6在甘草附子湯治療RA中起到了重要的作用，因此，對大鼠關節組織中選取Akt-1、TNFα和IL-6進行分析驗證。如圖10所示，經甘草附子湯治療后，AIA大鼠關節中的Akt-1、TNF-α和IL-6表達均有所降低，表明甘草附子湯可通過以上3個靶點，在TNF信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、HIF-1等信號通路中起到治療類風濕性關節炎的作用[6,19]。

圖4 甘草附子湯治療RA的GO富集條目氣泡圖

圖5 甘草附子湯治療RA的KEGG通路富集氣泡圖

表3 甘草附子湯治療RA部分蛋白靶點與信號通路信息

圖6 甘草附子湯治療RA靶點-通路網絡圖

圖7 各組大鼠關節組織學檢查（放大100倍）（）

圖8 給藥3周后大鼠足腫脹率（）

3 討論

RA是一種慢性疾病，早期常見癥狀是晨起之后關節僵硬，足關節等四肢小關節的對稱性疼痛、紅腫熱痛，并伴隨有低熱、免疫功能下降等，嚴重可致關節畸形[20]。該疾病因其高致殘率嚴重威脅人類健康，但其發病機制尚未完全闡明。中藥復方具有多成分、多靶點的特點，構成了一個可以協同發揮作用的整體，具有療效明確、安全性高、副作用少的優點，對于這種需長期服藥的疾病治療效果較好[21-22]。甘草附子湯是其中最有效的方劑之一[23]，在RA的防治中引起了越來越多的關注。

本研究運用網絡藥理學方法共檢索出甘草附子湯中623個化合物，結合當前對甘草附子湯化學成分進行探索的文章[24]，采用TCMSP、BATMAN-TCM和ETCM等數據庫盡可能全面的囊括甘草附子湯中的化學成分，彌補目前檢測方法對中藥復方復雜體系分析的局限性。根據目前實驗報道[16]，甘草附子湯在合煎與分煎過程中，并未產生化學成分種類的變化，數據庫信息具有代表性，本論文采用ADME原則作為篩選條件，對“甘草附子湯”進行網絡藥理學的分析。通過篩選可得甘草附子湯有效成分共136個，其中以甘草和附子成分為主，白術和桂枝較少，與文獻中報道成分分布一致[25-26]，將136個有效成分的靶點進一步通過與RA疾病的221個作用靶點進行比對，進一步得到甘草附子湯治療RA的潛在作用靶點127個。活性成分-靶點網絡分析預測顯示，甘草附子湯可通過槲皮素（Quercetin）、β 谷 甾 醇（Beta-sitosterol）、紫 杉 醇（Taxifolin）、甘草素（Glycyrrhizin）和烏頭堿（Aconitine）等活性成分發揮作用。黃酮類化合物槲皮素可通過兩種途徑減輕炎癥：①可使IL-6、IL-1β、IL-10等炎癥因子的表達水平降低；②通過減少炎癥細胞向關節部位的募集來緩解局部的炎癥[27]。β-谷甾醇可通過抑制表皮細胞中炎癥小體的激活，減少細胞中TNF-α、IL-8的生成發揮抗炎作用；還可以調節巨噬細胞的功能，減輕小鼠的類風濕炎癥[28-29]。紫杉醇通過靶向MAPK和AKT/mTOR信號通路抑制RA的滑膜細胞的遷移和炎癥介質（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）的產生[30]。甘草素能降低促炎細胞因子TNF-α表達水平，抑制小鼠骨關節炎軟骨破壞[31-32]?，F代藥理學研究表明，制附子主要活性成分烏頭堿可能通過降低血清NO、IL-1β水平、從而調控相關細胞因子的表達從而起到抗炎和消除關節腫脹的作用[33]。

圖9 給藥35天后大鼠血清中TNF-α（A）和IL-6（B）的水平（）

圖10 給藥35天后大鼠關節組織中TNF-α（A）、IL-6（B）和Akt-1（C）的表達水平（）

經網絡拓撲分析發現甘草附子湯治療RA發揮作用的主要靶點集中在炎癥和腫瘤相關的基因，由于炎癥與腫瘤存在錯綜復雜的關系[34]，因此交叉的通路中可能存在假陽性的可能。根據目前文獻報道進一步篩選，認為甘草附子湯治療RA的關鍵靶點為Akt1、TNF-α、IL-6、VEGFA、JUN、IL-1β、PTGS2、STAT3。Akt1是PI3K/AKT信號通路中重要的下游靶激酶，可通過多種途徑控制凋亡[35-36]。Akt1表達水平下調，造成促炎因子IL-1β、TNF-α的表達減少，抗炎因子IL-10表達增加，從而減少炎癥反應[37]。TNF-α在誘導類風濕性滑膜細胞中起主導作用，在RA患者的關節液和滑膜中表達，一方面可以介導白細胞在關節處聚集，刺激破骨細胞的形成和軟骨的降解，有效地誘導其他促炎介質的釋放[38]，另一方面直接通過刺激關節軟骨細胞中膠原酶的合成，促進滑膜炎癥[39]。目前抗風濕類藥物中，單克隆抗體英夫利昔單抗和阿達木單抗為阻斷TNF-α的免疫藥物，但此類藥物存在免疫抑制副作用，同時易于使患者出現針對藥物的抗體而影響藥物的活性[40]。在先天免疫方面，多效促炎細胞因子IL-6促進中性粒細胞遷移和單核細胞浸潤是RA發病的重要機制[41]。在RA患者受累關節的血清和滑液中，發現IL-6和TNF-α的水平升高[42]。研究發現IL-6、TNF-α、Akt的主要功能是刺激B細胞增殖以產生免疫球蛋白，并刺激滑膜以產生類風濕因子。因此，降低其表達水平可有效治療RA[43]。血管內皮生長因子A（VEGFA）可促進血管生成，在類風濕關節的缺氧狀態和抗炎細胞因子中表達水平上調[44]。JUN是JAKSTAT信號通路上的快速反應基因，可促進成骨細胞增殖、分化和骨細胞特異基因的表達[45]。關節中IL-1β的增加會加劇滑膜炎癥細胞浸潤，促進血管痙攣的形成，最終導致軟骨和骨骼的破壞[19,46]。前列腺素內環氧化合物合成酶2（PTGS2）是前列腺素合成的限速酶，可通過NF-κB通路激活并誘導軟骨細胞產生IL-6，造成軟骨損傷，抑制PTGS2的表達可減輕炎癥[47]。STATs是一類信號轉導與轉錄激活因子，STAT家族中STAT3活性最強，可調節炎癥因子表達，對RA發揮正反饋促進作用[48]。Oike等[49]通過構建可行的STAT3條件性敲除成年小鼠（Stat3 cKO），解決了Stat3 global KO小鼠顯示的早期胚胎致死性，并發現這種敲除小鼠能夠顯著抵抗膠原蛋白誘導的關節炎，與降低血清中IL-6和IL-17水平在體內拮抗關節炎癥有關。在KEGG通路富集分析中治療靶標主要富集在HIF-1、NF-κB、JAK-STAT等多條信號通路中。PI3K/Akt磷酸化[50]、NF-κB通路活化[51]可激活IL-1β誘導促炎因子TNF-α、IL-6的表達，介導大鼠關節炎癥的發生。研究發現下調JAK1/STAT3信號可使促炎細胞因子減少、MMPs抑制、炎性標記物減弱和炎性細胞凋亡，從而減輕RA臨床癥狀[52]。HIF-1在炎癥/先天免疫反應中發揮作用[53]，HIF-1通路激活引起NF-κB、促炎性細胞因子表達下調，起到炎癥保護作用[54]。因此甘草附子湯治療RA的機制與上述炎癥相關通路相關，與臨床或實驗研究相吻合[55]。本實驗根據以上分析結果，將度值＞90的關鍵靶點以佐劑型關節炎大鼠為模型進行驗證，結果表明甘草附子湯通過下調大鼠體內各通路中的Akt-1、TNF-α、IL-6表達發揮對RA的治療作用。

綜上所述，本文參考《網絡藥理學評價方法指南》，運用網絡藥理學研究藥物與靶蛋白或基因與疾病之間的代謝途徑，從信息學的角度描述生物系統、藥物和疾病之間的復雜性[56]，適用于類風濕性疾病等發病機制尚不清晰的疾病，與多成分多靶點交互作用的中藥復方。通過動物實驗對甘草附子湯治療RA的作用效果和潛在的信號通路進行驗證，為甘草附子湯的廣泛應用提供了理論支撐。但一方面由于有效成分為預測值，缺乏藥代動力學的相關體內參數，另一方面，中藥復方存在多組分、多途徑、多靶點的特點，預測的關鍵靶點并不能完全代表中藥的整體觀，需要進一步完善甘草附子湯在體內藥效成分的探究，運用強大的信息化技術科學、系統地闡釋傳統中醫藥。