科爾沁牛乳腺炎無乳鏈球菌cylE基因的克隆及抗原性分析

馮浩展，任憲峰，王 華，錫林高娃

（內蒙古民族大學生命科學與食品學院，內蒙古乳源性致病菌工程防控中心，內蒙古 通遼 028043）

乳腺炎是奶牛最常見且較為多發的一種乳腺疾病，乳腺炎不僅影響乳汁品質，而且降低產奶量。我國因臨床型奶牛乳腺炎淘汰的奶牛約占總淘汰牛的9%～11%，造成的經濟損失超過了3.16億元[1]。B族鏈球菌（GBS）學名無乳鏈球菌（streptococcus agalactiea,S.agalactiea），GBS感染引發的乳腺炎是最常見的疾病之一。同時無乳鏈球菌也能引發奶牛乳腺炎并通過乳制品感染人類。其感染人群主要為飲用乳制品及接觸奶牛的免疫缺陷者[2]。據國外流行病學調查顯示，在引起敗血癥的致病菌中，無乳鏈球菌占敗血癥總致病菌數的85%以上[3]。同時，GBS也是造成孕婦產褥期膿毒血癥和新生兒腦膜炎的一個重要原因。該菌寄生在產婦生殖道內，可導致嬰兒發生感染[4]，也可引起產后感染、菌血癥、心內膜炎、皮膚和軟組織感染及骨髓炎。更為重要的是GBS通過牛奶和肉類等對孕婦和老人等免疫力低下或免疫功能不全的人群造成感染，引起敗血癥和心內膜炎等疾病[5]。

溶血素又稱細胞溶素，根據在血瓊脂培養基上的溶血特征可分為α溶血素、β溶血素和γ溶血素3種類型?？茽柷吲Ｈ橄傺资怯搔氯苎蜔o乳鏈球菌造成的，它分泌的β-溶血素屬于穿孔毒素[6]，它能溶解紅細胞并使紅細胞釋放血紅蛋白。溶血素不同于其他通過哺乳動物靶細胞內化的毒素，而是作用于細胞膜，造成其結構和功能的紊亂，使大量細胞內的成分泄漏，導致細胞死亡。更可怕的是溶血素不僅溶解紅細胞，還損害其他多種類型的真核細胞，包括血小板、成纖維細胞、心肌細胞、單核細胞、粒細胞和內皮細胞等[7]。

近年來，人們發現溶血素并非是cylE基因的表達產物。Rosa-Fraile等[8]的研究提出，GBS的溶血性和細胞溶解活性是由鳥氨酸鼠李糖多烯色素而不是由cylE蛋白引起的。布日額等[9]通過構建cylE基因缺陷型菌株發現，缺失cylE基因的無乳鏈球菌將失去溶血性，因此cylE基因對溶血素的產生是必要的。如今，由于抗生素的濫用，導致耐藥菌的數量和種類持續增加，病原菌的防控依然是比較有效的手段，這就需要找到病原菌攜帶的有效免疫抗原。通過克隆科爾沁牛乳腺炎無乳鏈球菌cylE基因并分析其編碼蛋白性質，為以后研究溶血素合成途徑及制備無乳鏈球菌新型疫苗做理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無乳鏈球菌為內蒙古通遼地區患乳腺炎科爾沁牛的乳汁臨床分離株；大腸桿菌DH5α、pMD 18-T載體、Ecor I與 Hind III內切酶、Taq DNA聚合酶、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒及小量質粒提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 引物設計與合成

參照GenBank已公布牛源無乳鏈球菌的cylE基因序列(AF093787)，采用Primer 5.0軟件設計1對引物，序列如下：

cylE1：CGAAAGCTTATGAAAGATGATAATA；

cylE2：TCGGAATTCTCATTTTTCTTCACACTT。

1.3 無乳鏈球菌DNA模板制備

將科爾沁牛乳腺炎臨床分離獲得的無乳鏈球菌進行純化培養，然后參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA，經電泳鑒定后置于-20℃冰箱保存備用。

1.4 目的基因的PCR擴增

PCR 反應體系 50.0 μL,10×PCR Buffer 5.0 μL,dNTP 4.0 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各 1.0 μL,DNA 模板 5.0 μL,Taq DNA 合酶 (5 U/μL)0.25 μL,ddH2O 33.75 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s，進行30個循環;72℃延伸10 min,4℃保存。

1.5 克隆載體構建與鑒定

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA凝膠回收試劑盒進行回收。將回收的片段與pMD 18-T載體在16℃下連接過夜后，轉化DH5α感受態細胞，用含有氨芐青霉素(Amp+)的LB培養基對菌落進行篩選，并提取重組質粒。提取的重組質粒命名為pMD 18-T-cylE，同時進行PCR及酶切鑒定。

1.6 目的基因序列分析

將轉化重組質粒pMD 18-T-cylE的感受態細胞DH5α送至北京華大基因研究中心進行測序，利用DNASTAR軟件對其推導蛋白二級結構及其抗原性進行預測分析。

2 結果與分析

2.1 目的基因的PCR擴增結果

從患乳腺炎科爾沁牛乳汁中分離獲得的無乳鏈球菌基因組總DNA為模板，合成的P1/P2為引物進行cylE基因PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，發現在1000 bp附近有一條特異條帶(見圖1)，與預期結果相符。

圖1 cylE基因PCR擴增產物的電泳鑒定結果

2.2 重組質粒的PCR及酶切鑒定結果

重組質粒pMD 18-T-cylE經PCR鑒定，結果擴增出約1000 bp的片段;經Hind III單酶切后得到約3700 bp的片段;經Ecor I、Hind III雙酶切則得到約1000 bp和2700 bp的兩個片段(見圖2)。酶切獲得的片段及PCR擴增片段均與預期結果相符，說明重組質粒構建正確。

圖2 重組質粒pMD 18-T-cylE的酶切PCR及酶切鑒定結果

2.3 基因序列及其推導氨基酸序列分析結果

重組質粒pMD 18-T-cylE經測序結果發現，無乳鏈球菌cylE基因片段共由999個堿基組成。將克隆獲得的cylE基因序列與Genbnak已公布的牛源無乳鏈球菌cylE基因序列進行比對,其兩者核苷酸序列相似性為99.9%，僅有1個核苷酸發生突變（1712C→A）。

2.4 氨基酸序列及其二級結構預測分析結果

通過DNASTAR軟件分析，經克隆獲得的cylE基因序列共編碼333個氨基酸。與Genbnak已公布的牛源無乳鏈球菌cylE基因序列進行比對，其兩者氨基酸序列相似度為99.7%，僅有1處氨基酸發生了突變571Ala→Asp。

使用PSIPRED在線分析網站，對cylE蛋白序列的二級結構進行分析。結果顯示，無乳鏈球菌cylE蛋白共有63個α-螺旋，有133個β-折疊。其中α-螺旋占 18.92%（63/333），β-折疊占 39.93%（133/333）。其余為無規則卷曲。

2.5 cylE基因預測蛋白的親水性及其抗原性預測分析

圖3 cylE基因序列的相似性分析結果

圖4 cylE基因編碼氨基酸序列的相似性分析結果

圖5 cylE基因編碼蛋白質二級結構的預測分析結果

使用DNASTAR軟件對cylE基因氨基酸序列進行分析。結果表明，cylE預測蛋白的親水區域較廣，其主要分布在 6～19、30～40、67～151、184～198、208～229、244～285和307～331位氨基酸。而且親水區域在蛋白序列的N端較多。根據Jameson-Wolf方案預測其抗原指數。cylE預測蛋白含有較多抗原指數較高的區域，主要分布在 4～16、24～39、56～62、67～76、90～99、108～124、128～149、156～161、171～184、228～207、241～251、258～281和321～330位氨基酸，抗原性良好。綜上所述，cylE蛋白是親水蛋白，具有良好的抗原性。

圖6 cylE基因編碼蛋白質疏水性及抗原性的預測分析結果

3 討論

至今為止，cylE的作用機制尚未明了，但它卻對溶血素的產生有著至關重要的作用，在無乳鏈球菌的較多致病因子中，溶血素起著破壞宿主細胞、使細胞內成分大量泄漏和導致細胞死亡的作用，是無乳鏈球菌致病的主要因子。

根據試驗測序獲得cylE基因序列為999 bp，使用獲得序列與NCBI數據庫對比后發現，相似性為99.9%，其中原1712位的C突變為A，導致其氨基酸序列第571位丙氨酸突變為天冬氨酸。

Whidbey等[10]的研究表明，溶血素的實質是名為鳥氨酸鼠李糖脂的色素，值得注意的是，cylE基因的存在是溶血素產生的必要條件。目前雖然針對表面蛋白的疫苗在小鼠感染模型中被證明能提供抗GBS的保護[11]，但基于蛋白質的疫苗不能中和這種脂質毒素的作用，我們可以針對cylE基因表達產物制作疫苗來抑制溶血素的產生。而本試驗通過對cylE蛋白序列進行親水性和抗原性分析發現，cylE蛋白具有較高的親水性，同時也具有良好的抗原性。符合候選靶標抗原的要求，說明cylE蛋白是防治無乳鏈球菌病的理想抗原候選分子。

科爾沁牛乳腺炎無乳鏈球菌cylE基因編碼的蛋白具有良好的抗原性，可作為防治無乳鏈球菌的抗原候選分子之一，為后續研究預防牛乳腺炎疫苗提供理論參考依據。