苦蕎黃酮通過(guò)JHDM1D-AS1對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的影響

李 朋，徐建輝，胡 威

心血管疾病是全球死亡相關(guān)的主要病因，嚴(yán)重危害人們的健康，心肌缺血/再灌注損傷被認(rèn)為是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，近年來(lái)，研究表明中醫(yī)藥治療心血管疾病療效確切，安全性高[1]。苦蕎即苦蕎麥，是一種重要的藥食兩用植物，其主要活性成分苦蕎黃酮具有降血糖、降血脂、抗氧化、清除氧自由基等作用，可開發(fā)用于防治心腦血管疾病[2]。研究報(bào)道苦蕎麥黃酮可能通過(guò)提高氧自由基清除能力，抑制氧自由基產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，對(duì)大鼠缺血再灌注心肌具有一定的保護(hù)作用[3]。復(fù)方苦蕎麥制劑可能通過(guò)抑制心肌脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)大鼠糖尿病心肌損傷具有保護(hù)作用[4]。苦蕎麥總黃酮對(duì)軟脂酸損傷的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[5]。以上研究表明苦蕎黃酮對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。研究表明LncRNA和miRNA在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，與細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激、炎癥和線粒體功能障礙有關(guān)[6]。研究報(bào)道上調(diào)JHDM1D反義RNA1(JHDM1D-AS1)通過(guò)靶向miR-101-3p-DUSP1減輕臂叢神經(jīng)損傷后的脊髓中神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷[7]。然而JHDM1D-AS1對(duì)心肌損傷的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究苦蕎黃酮是否通過(guò)調(diào)控JHDM1D-AS1影響心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自美國(guó)ATCC；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；苦蕎黃酮購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾美捷科技有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京麥瑞博生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組 心肌細(xì)胞H9c2用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將其接種至預(yù)先用95%N2+5%CO2飽和過(guò)的無(wú)血清無(wú)糖的DMEM培養(yǎng)基，并將其置于95%N2+5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h模擬缺氧，然后換成含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在正常CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h模擬復(fù)氧，作為缺氧/復(fù)氧(H/R)組；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組。將H9c2按上述方法缺氧4 h后，換成含 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L苦蕎黃酮的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，作為H/R+苦蕎黃酮低、中、高劑量組；將pcDNA、pcDNA-JHDM1D-AS1轉(zhuǎn)染至H9c2中，然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧，記為H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-JHDM1D-AS1組；將si-NC、si-JHDM1D-AS1轉(zhuǎn)染至H9c2中，然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧，再用200 μg/L苦蕎黃酮處理，記為H/R+苦蕎黃酮+si-NC組、H/R+苦蕎黃酮+si-JHDM1D-AS1組。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，消化、離心、洗滌后置于流式管中，加入300 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(Annexin Ⅴ-FITC)染液和碘化丙啶(PI)染液各5 μL，避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，配膠，取出蛋白樣品進(jìn)行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后將蛋白通過(guò)90 V恒壓90 min轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，取出膜后加5%脫脂奶粉封閉1 h，加入特異性Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、淋巴瘤B細(xì)胞-2(Bcl-2)一抗4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗室溫反應(yīng)2 h，加入電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，曝光，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 試劑盒檢測(cè)SOD活性和MDA水平 收集各組細(xì)胞，按照SOD及MDA試劑盒說(shuō)明書的步驟要求進(jìn)行操作，分別于對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞的光密度(OD)值，按各說(shuō)明書的公式測(cè)定各組SOD活性和MDA水平。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)JHDM1D-AS1和miR-421的表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA后，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。以GAPDH和U6為內(nèi)參，JHDM1D-AS1正向引物序列：5′-CCTCGCGACGCTGAGAGAATC-3′，反向引物序列：5′-ACGGCACATTCCTCCCTCGGA-3′；GAPDH正向引物序列：5′-GATACACGGAGCACCAGGTT-3′，反向引物序列：5′-CAGGTCACATACACGGTTGC-3′；miR-421正向引物序列：5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′，反向引物序列：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；U6正向引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，反向引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建JHDM1D-AS1的野生型和突變型熒光素酶載體，然后分別與miR-NC和miR-421通過(guò)脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，按照說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 苦蕎黃酮對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，H/R組心肌細(xì)胞凋亡率升高，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，SOD活性降低，MDA水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+苦蕎黃酮低劑量組、H/R+苦蕎黃酮中劑量組、H/R+苦蕎黃酮高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率降低，Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。詳見圖1、表1。

與Con組比較，＊ P<0.05；與H/R組比較，# P<0.05；與H/R+苦蕎黃酮低劑量組比較，△ P<0.05；與H/R+苦蕎黃酮中劑量組比較，& P<0.05。

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡率及SOD活性、MDA水平比較(±s，n=3)

2.2 苦蕎黃酮對(duì)H/R心肌細(xì)胞中JHDM1D-AS1和miR-421表達(dá)的影響 與Con組比較，H/R組心肌細(xì)胞中JHDM1D-AS1表達(dá)水平降低，miR-421表達(dá)水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+苦蕎黃酮低劑量組、H/R+苦蕎黃酮中劑量組、H/R+苦蕎黃酮高劑量組心肌細(xì)胞中 JHDM1D-AS1升高，miR-421表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組JHDM1D-AS1和miR-421表達(dá)比較(±s，n=3)

2.3 JHDM1D-AS1對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激的影響 與H/R組和H/R+pcDNA組比較，H/R+pcDNA-JHDM1D-AS1組JHDM1D-AS1表達(dá)水平升高，miR-421表達(dá)水平降低，心肌細(xì)胞凋亡率降低，Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、表3。

與H/R組比較，＊ P<0.05；與H/R+pcDNA組比較，# P<0.05。

表3 各組JHDM1D-AS1、miR-421、心肌細(xì)胞凋亡率、SOD活性、MDA水平比較(±s，n=3)

2.4 JHDM1D-AS1和miR-421靶向關(guān)系的驗(yàn)證 JHDM1D-AS1和miR-421具有互補(bǔ)的核苷酸序列；wt-JHDM1D-AS1與miR-421共轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞熒光素酶活性降低，而mut-JHDM1D-AS1與miR-421共轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化。詳見圖3。

與miR-NC組比較，＊ P<0.05。

2.5 抑制JHDM1D-AS1可逆轉(zhuǎn)苦蕎黃酮對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激的影響 與H/R組比較，H/R+苦蕎黃酮組JHDM1D-AS1表達(dá)水平升高，miR-421表達(dá)水平降低，心肌細(xì)胞凋亡率降低，Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H/R+苦蕎黃酮+si-NC組比較，H/R+苦蕎黃酮+si-JHDM1D-AS1組JHDM1D-AS1表達(dá)水平降低，miR-421表達(dá)水平升高，心肌細(xì)胞凋亡率升高，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，SOD活性降低，MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4、表4。

與H/R組比較，＊ P<0.05；與H/R+苦蕎黃酮+si-NC組比較，# P<0.05。

表4 抑制JHDM1D-AS1對(duì)苦蕎黃酮作用的心肌細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激的影響(±s，n=3)

3 討 論

心肌細(xì)胞H/R模型是模擬心肌缺血再灌注損傷及相關(guān)疾病的經(jīng)典細(xì)胞模型[8]，因此，本實(shí)驗(yàn)用H/R處理心肌細(xì)胞建立損傷模型，結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞的凋亡率升高，SOD活性降低，MDA水平升高，表明H/R誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。研究報(bào)道，苦蕎黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路有效防止高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗和肝氧化應(yīng)激[9-10]。苦蕎黃酮可改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能[11]。本實(shí)驗(yàn)用不同劑量苦蕎黃酮處理H/R作用的心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞凋亡率降低，Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低。表明苦蕎黃酮抑制了H/R作用的心肌細(xì)胞損傷。

研究報(bào)道，上調(diào)JHDM1D-AS1通過(guò)磷酸化真核起始因子2α(eIF2α)降低DNAJC10，從而保護(hù)牙周膜干細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H/R處理心肌細(xì)胞中JHDM1D-AS1表達(dá)水平降低，過(guò)表達(dá)JHDM1D-AS1后，心肌細(xì)胞凋亡率降低，SOD活性升高，MDA水平降低。表明過(guò)表達(dá)JHDM1D-AS1抑制了H/R作用的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，提示JHDM1D-AS1有抗細(xì)胞損傷作用。且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JHDM1D-AS1可靶向調(diào)控miR-421，研究報(bào)道抑制miR-421通過(guò)靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子3(Sirt3)保護(hù)H9c2細(xì)胞免受H/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[13]。下調(diào)miR-421通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激緩解了腦缺血/再灌注損傷[14]。CircPAN3通過(guò)靶向miR-421/張力蛋白同源基因誘導(dǎo)的假定激酶1(Pink1)軸介導(dǎo)的自噬抑制來(lái)改善心肌缺血/再灌注損傷[15]。表明miR-421參與H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。提示JHDM1D-AS1可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-421影響心肌細(xì)胞損傷。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，苦蕎黃酮可提高JHDM1D-AS1的表達(dá)水平，降低miR-421的表達(dá)水平，提示苦蕎黃酮可能調(diào)控JHDM1D-AS1/miR-421。

綜上所述，苦蕎黃酮通過(guò)調(diào)控JHDM1D-AS1/miR-421抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。